氯化銨對日本沼蝦存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影響【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設計)</p><p>　題 目：氯化銨對日本沼蝦存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影響</p><p>　學 院：</p><p>　學生姓名：</p><p>　專 業(yè)：水產養(yǎng)殖</p><p>　班 級：</p><p>　指導教師：&

2、lt;/p><p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　中文摘要1</b></p><p><b>　　英文摘要1</b></p><p><b>　　1. 前言1</b></

3、p><p><b>　　2. 實驗材料2</b></p><p><b>　　2.1日本沼蝦2</b></p><p>　　2.2 主要實驗儀器2</p><p>　　2.3 抗氧化酶活力測定試劑盒3</p><p>　　2.4 實驗用水3</p><

4、;p><b>　　3. 實驗方法3</b></p><p>　　3.1 氯化銨對日本沼蝦急性毒性實驗3</p><p>　　3.2 氯化銨對日本沼蝦呼吸耗氧率的影響實驗3</p><p>　　3.3 氯化銨對日本沼蝦鰓組織抗氧化酶（CAT、GSH）活力的影響實驗3</p><p><b>　

5、　4．數據處理3</b></p><p><b>　　5．實驗結果4</b></p><p>　　5.1 氯化銨對日本沼蝦急性毒性4</p><p>　　5.2 氯化銨對日本沼蝦呼吸耗氧率的影響5</p><p>　　5.3 氯化銨對日本沼蝦鰓組織抗氧化酶（CAT、GSH）活力的影響5</p&

6、gt;<p><b>　　6.討論7</b></p><p>　　6.1日本沼蝦對氯化銨的耐受響應特征7</p><p>　　6.2日本沼蝦的氯化銨安全濃度的確定8</p><p><b>　　小結8</b></p><p><b>　　致謝9</b>&

7、lt;/p><p><b>　　參考文獻10</b></p><p>　　氯化銨對日本沼蝦存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影響</p><p>　　[摘要]本實驗主要進行的是氯化銨對日本沼蝦耐受程度和響應特征的研究，經過對實驗眼界結果的處理分析，主要得到以下幾點：（1）NH4Cl對日本沼蝦在實驗周期（24h、48h、72h、96h）內的的半致死濃度分

8、別為37.014±0.361mg·L-1、13.209±0.361 mg·L-1，7.038±0.360 mg·L-1、4.712±0.340 mg·L-1；（2）NH4Cl脅迫會明顯影響到日本沼蝦的呼吸耗氧率，實驗設定內的NH4Cl質量濃度為0.157 mg·L-1～0.785 mg·L-1，這些組中，日本沼蝦的日均呼吸耗氧率和夜均呼吸

9、耗氧率均顯著高于空白組；NH4Cl質量濃度為2.000 mg·L-1的實驗組中，日本沼蝦的日均呼吸耗氧率和夜均呼吸耗氧率都明顯比空白組的低；（3）當NH4Cl質量濃度小于等于0.471 mg·L-1時，日本沼蝦抗氧化酶（CAT、GSH）活力在實驗周期內都高于對照組，而NH4Cl質量濃度高于0.471 mg.L-1的實驗組，當實驗周期進行至96h時，日本沼蝦的抗氧化酶（CAT、GSH）活力均低于對照組。</p&g

10、t;<p>　　[關鍵詞] 日本沼蝦 氯化銨 耗氧率 半致死濃度 耐受特征</p><p>　　Ammonium chloride the nipponense survival, oxygen consumption rate and antioxidant enzyme activity in</p><p>　　[ABSTRACT] Tolerance and

11、 response of Macrobrachium nipponense to NH4Cl concentration were studied. Acute semistatic toxicity tests were carried out for 96h with Macrobrachium nipponense. SC（safe concentration）and LC50（half lethal concentration

12、）indiced for NH4Cl were determined. The result indicated that：（1）The LC50-24h，LC50-48h，LC50-72h，and LC50-96h values in this study were 37.014±0.361mg·L-1、13.209±0.361mg·L-1、7.038±0.360mg·L-1

13、、4.712±0.340mg·L-1，respectively. The SC-96h value were 0.4712±0.03</p><p>　　[KEYWORDS]: Macrobrachium nipponense pH NH4Cl Tolerance Response</p><p>　　氯化銨對日本沼蝦存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影

14、響</p><p><b>　　1. 前言</b></p><p>　　蝦類隸屬于節(jié)肢動物門，它分布廣泛，有近2000種，是一種世界性的養(yǎng)殖品種。蝦類養(yǎng)殖雖然產量不能和魚類、貝類相比，但產值較高，屬于名、特、優(yōu)產品，因此在我國水產養(yǎng)殖中占有重要地位。蝦類在整個生活史過程中都受到其所生活的水環(huán)境中生物因子和非生物因子的影響，而對于此有機體往往采取從個體、組織到分子水平的

15、一系列適應性調整，以適應或提高其在變化了的環(huán)境條件下的存活和生長的需要[5]。在自然和養(yǎng)殖條件下，由于環(huán)境的時刻變化（周期性、季節(jié)性和人為的波動），蝦類通過自身一系列機制調整其生理和生態(tài)的適應性[6]以適應環(huán)境脅迫帶來的影響，對于魚類、貝類的逆境生態(tài)學研究已有大量報道，相對于魚類和貝類，蝦類的生活史特殊（蛻皮現象），從而更加引起了研究者們的興趣。</p><p>　　蝦類逆境生態(tài)學的研究作為其生理生態(tài)學的重要研究

16、內容，已為揭示蝦類在逆境脅迫下機體自身一系列的生理和生態(tài)適應特性提供了重要依據，無疑為蝦類的養(yǎng)殖生產作出了重要貢獻。本文就逆境生態(tài)因子脅迫下蝦類的耐受與響應特征的研究做一綜述。</p><p>　　日本沼蝦在世界上的地理分布較狹窄，僅限于日本和我國。在我國，日本沼蝦廣泛分布于南北各地的江河湖泊中，也常出現在低鹽度的河口地帶。特別是在江蘇太湖、河北白洋淀、山東微山湖等處的日本沼蝦最為著名。日本沼蝦是我國淡水蝦類中個

17、體較大的一種，其適應性較強、分布比較廣泛，但自然水域中的資源量較為有限，因其具有食性雜、養(yǎng)殖周期短、繁殖能力強、肉質細嫩等特點，是目前我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中重要的養(yǎng)殖對象和最有發(fā)展前途的品種之一。此外，日本沼蝦作為其生存環(huán)境的食物鏈中魚類的餌料生物也有重要意義，可見日本沼蝦具有極高的經濟價值和生態(tài)學地位，有著廣闊的增養(yǎng)殖開發(fā)和研究前景。我國的淡水蝦類養(yǎng)殖品種主要有日本沼蝦和羅氏沼蝦（Macrobrachium rose--nbergii）。日

18、本沼蝦肉的蛋白質含量介于對蝦與羅氏沼蝦之間，除色氨酸外人體其余的7種必需氨基酸含量，均高于對蝦和羅氏沼蝦[2]，因此日本沼蝦養(yǎng)殖在我國淡水蝦類養(yǎng)殖業(yè)中占有重要位置。為此，有必要首先通過了解日本沼蝦生物學特性和養(yǎng)殖現狀，進而對其進行系統(tǒng)的研究，以達到科學養(yǎng)殖的目的。由于水生生物生活史和生存環(huán)境的差異，如蝦蟹類在生活史中出現蛻皮現象，使得水生生</p><p>　　本實驗主要的主要任務是研究日本沼蝦對氯化銨的耐受程度

19、及特征的響應。經實驗的相關測定和分析，順利完成了實驗，并取得了一些結果。氨化作用是養(yǎng)殖水域中微生物作用的重要途徑，而氨氮則是評價水質優(yōu)劣的重要指標及引發(fā)養(yǎng)殖生物疾病的重要因子。所以，確保生物的正常生長、發(fā)育和繁殖的關鍵則在于有效控制養(yǎng)殖水體的氨氮水平。而且，控制好養(yǎng)殖水體氨氮平衡是促進水產養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展的基礎和前提。</p><p>　　氨氮對水產養(yǎng)殖生物的危害已引起了全球水產養(yǎng)殖學界的普遍廣泛關注和高度

20、重視。同時，國內外已針對氨氮對中華絨螯蟹幼體、羅氏沼蝦幼、中國對蝦、斑節(jié)對蝦、、文蛤、黃顙魚等許多水產養(yǎng)殖動物進行了生態(tài)毒理學的相關探討和深入研究，相比之下，卻很少有較為獨到和新穎的關于氨氮對日本沼蝦的急性毒性等病理學的的研究報道。因此，進行這樣一項研究實驗對于認識和了解氯化銨對日本沼蝦的影響具有科學價值和研究意義。該實驗主要分五階段進行開展：第一，是相關文獻的收集和整理；第二，是預備實驗的探索；第三，是正式實驗的展開；第四，是實驗結果

21、的處理；第五，是總結實驗結論。其中，主要包括對日本沼蝦氯化銨對日本沼蝦的急性毒性實驗、耗氧率的影響以及對抗氧化酶活力的測定。通過該實驗的研究和分析總結，主要是想為日本沼蝦的安全高效生產和生態(tài)科學養(yǎng)殖提供更穩(wěn)定更安全更可靠的水產養(yǎng)殖的生態(tài)環(huán)境。</p><p><b>　　2. 實驗材料</b></p><p><b>　　2.1日本沼蝦</b>&

22、lt;/p><p>　　所用日本沼蝦購于余姚市青港野生苗種廠，運回實驗室后，暫養(yǎng)于規(guī)格為70cm×48cm×37cm的水箱中，連續(xù)充氣，不投食，及時撈出死亡個體，每24h換水一次。待其排空糞便后隨即選取規(guī)格相近，肢體完好、健壯有活力且體色接近的非抱卵日本沼蝦作為實驗對象，規(guī)格為：體長（4.29±0.32）cm、體重（1.80±0.12)g。</p><p&g

23、t;　　2.2 主要實驗儀器</p><p>　　規(guī)格為55cm×40cm×30cm和80cm×50cm×42cm的塑料箱；JPSJ-605臺式溶解氧測定儀； pH計； Sartorius BP211D 電子天平；722S可見分光光度計；Anke TDL-40B臺式離心機；ATINAN加熱棒；UPWS純水機。</p><p>　　如圖1所示，仿照黃

24、玉瑤等（1975）的流水密封裝置設計日本沼蝦呼吸耗氧率的測定系統(tǒng)，其中A為水塔，G為虹吸管，L為流量控制開關，C為呼吸室（規(guī)格30cm×30cm×12cm），D為恒溫水槽，I為已耗氧水暫存瓶，E為出水槽，F為玻璃管。</p><p>　　圖1 日本沼蝦呼吸耗氧率測定裝置</p><p>　　Figure 1 Macrobrachium respiration rate

25、measurement device</p><p>　　2.3 抗氧化酶活力測定試劑盒</p><p>　　CAT活力測定試劑盒（可見光法）、GSH酶活力測定用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，測定日本沼蝦抗氧化酶（CAT、GSH）活力。</p><p><b>　　2.4 實驗用水</b></p><p>　　實驗

26、基礎水為經48h曝氣的自來水，水溫24±0.2℃，OD值7.24±0.14mg·L-1，pH7.11±0.07，水質符合NY5051-2001無公害食品淡水養(yǎng)殖用水水質標準（中華人民共和國農業(yè)部，2001)，適量的1g·L-的NH4Cl（國藥集團化學試劑有限公司生產）母液調配成不同NH4Cl濃度的實驗水。</p><p><b>　　3. 實驗方法<

27、;/b></p><p>　　3.1 NH4Cl對日本沼蝦急性毒性實驗</p><p>　　經預備實驗，確定NH4Cl對日本沼蝦急性毒性的實驗質量濃度范圍（96h全活濃度下限和全死濃度上限），按等對數間距法設置0.000mg·L-1、4.000mg·L-1、7.000mg·L-1、11.000mg·L-1、17.000mg·L-1、2

28、8.000mg·L-1等6個NH4Cl質量濃度梯度組，以規(guī)格為55cm× 40cm×30cm的塑料箱為實驗單元，每單元盛實驗水20L，實驗時隨機挑選10尾日本沼蝦放入實驗容器單元中，每個梯度3個重復，采用靜水停食法開展NH4Cl對日本沼蝦的96h急性毒性效應實驗。實驗周期為96h，每24h換一次水；連續(xù)觀察蝦的活動狀況，以用玻璃棒觸碰蝦體無反應作為死亡的標準，隨時撈出死蝦并記錄死亡現象和死亡數量。</

29、p><p>　　3.2 NH4Cl對日本沼蝦呼吸耗氧率的影響實驗</p><p>　　據NH4Cl對日本沼蝦的急性毒性實驗結果，以自然狀態(tài)為對照組，按等差間距法設置0.157mg·L-1、0.314mg·L-1、0.471mg·L-1、0.628mg·L-1、0.785mg·L-1、0.942mg·L-1、2.000mg·L

30、-1（96全活濃度下限）等8個質量濃度梯度，每梯度重復3次，采用流水呼吸室法（單位時間水流量為4.32±0.67L·h-1)開展對日本沼蝦晝夜耗氧率的影響實驗。實驗前同時隨機選取4尾實驗蝦放入對應的呼吸室內，穩(wěn)定1h后，于翌日0:00起每隔1次測定呼吸室流入水與流出水的水溫和DO值，連續(xù)測定24h。實驗期間保持pH值恒定。實驗結束后，用濾紙吸凈對應的呼吸室內實驗蝦體表水分并稱其體重。</p><p

31、>　　3.3 NH4Cl對日本沼蝦鰓組織抗氧化酶（CAT、GSH）活力的影響實驗</p><p>　　以自然狀態(tài)為對照組，按等差間距法設置0.157mg·L-1、0.314mg·L-1、0.471mg·L-1、0.628mg·L-1、0.785mg·L-1、0.942mg·L-1、2.000mg·L-1等8個質量濃度梯度，每梯度重復3次

32、，測定日本沼蝦鰓組織的CAT活力和GSH活力。</p><p>　　于實驗第24h、48h、72h、96h分別取樣一次，每次每實驗單元各隨機取實驗蝦3尾，于并盤上解剖取其鰓組織并準確稱重，用玻璃勻漿器充分研磨后，用0.86%的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，4℃保存?zhèn)錅y。按照CAT、GSH測試盒的測定方法將組織勻漿液稀釋至相應濃度后進行測定。</p><p><b>　　4．數據

33、處理</b></p><p>　　呼吸耗氧率（mg·g-1·h-1）=（DO1－DO2）×V/W</p><p>　　式中：DO1、DO2分別指進水口、出水口溶氧量（mg·L-1），V指單位時間流量（L·h-1），W指同一呼吸室中所有實驗對象體重之和（g）。</p><p>　　CAT活力、GSH活力的計

34、算方法按照南京建成生物工程研究所生產的酶活力測試試劑盒的方法進行測定。</p><p>　　根據NH4Cl對日本沼蝦急性毒性實驗的結果，建立不同觀察時段死亡概率單位—質量濃度對數直線回歸方程。NH4Cl對日本沼蝦的安全濃度計算公式如下：</p><p>　　SC=0.1×96hLC50 </p><p>　　所得數據運用SPSS17.0經統(tǒng)計學分析，并利用

35、LSD法進行差異性比較，顯著水平為P<0.05。</p><p><b>　　5．實驗結果</b></p><p>　　5.1 NH4Cl對日本沼蝦急性毒性</p><p>　　由表1可見，同一時段內實驗對象的死亡率隨NH4Cl質量濃度的增高而增高，同一實驗質量濃度梯度內實驗對象的死亡率隨時間的延長而增高，表現出明顯的計量效應和時間效應。

36、對表1結果作統(tǒng)計學處理得表2。由表2可見，NH4Cl對日本沼蝦24h、48h、72h、96h的半致死濃度分別為37.014±0.361mg·L-1、13.209±0.361mg·L-1、7.038±0.360mg·L-1、4.712±0.340mg·L-1。觀察發(fā)現，死亡個體肌肉和鰓組織發(fā)白，內臟松散呈流質狀。</p><p>　　表

37、1 NH4Cl對日本沼蝦急性毒性</p><p>　　Table 1 of NH4Cl on the acute toxicity of nipponense</p><p>　　表2 不同觀察時段NH4Cl對日本沼蝦的急性毒性特征的分析</p><p>　　Table 2 Analysis of the different observation periods

38、 NH4Cl on the acute toxicity characteristics of the Japanese marsh shrimp</p><p>　　5.2 NH4Cl對日本沼蝦呼吸耗氧率的影響</p><p>　　如表3所示，各NH4Cl質量濃度梯度組中，日本沼蝦的日呼吸耗氧率都顯著低于夜呼吸耗氧率（P<0.05）。同時可見，NH4Cl的質量濃度為0.157mg&

39、#183;L-1、0.314mg·L-1、0.471mg·L-1、0.628mg·L-1、0.785mg·L-1五個實驗組的日呼吸耗氧率和夜呼吸耗氧率也明顯比對照組（P<0.05）高；0.942mg·L-1這一實驗組中，日呼吸耗氧率與對照組沒有顯著的差異，但夜呼吸耗氧率卻顯著低于對照組（P<0.05）；2.000mg·L-1實驗組相對于對照組（P<0.05），

40、其日呼吸耗氧率和夜呼吸耗氧率都偏低。</p><p>　　表3 NH4Cl對日本沼蝦呼吸耗氧率的影響</p><p>　　Table 3 of NH4Cl on the respiration rate of nipponense</p><p>　　注：x、y代表同一行間的差異；w、v表示同一列間的差異；不同字母表差異性（P<0.05）</p>

41、<p>　　5.3 NH4Cl對日本沼蝦鰓組織抗氧化酶（CAT、GSH）活力的影響</p><p>　　如圖2可知，在實驗周期內，當NH4Cl質量濃度小于等于0.471mg·L-1時，日本沼蝦鰓組織Cat的活力均比對照組高；NH4Cl質量濃度為0.628mg·L-1、0.785mg·L-1的兩個實驗組在實驗周期內會呈現不同的變化階段：在24h、48hCAT的活力高于對照組

42、，到72h時與對照組相均衡，而在96h時開始低于對照組；0.942mg·L-1、2.000mg·L-1兩實驗組別的鰓組織CAT活力也出現周期時段變化：24h時高于對照組，48h同對照組持平，72h、96h都比對照組低。</p><p>　　如圖2所示，GSH活力則在24h達到最大值，各個實驗組均有這一特點；到48h都開始出現不同幅度的下降趨勢，除0.785mg·L-1的實驗組之外；在

43、48h時，質量濃度在0.942mg·L-1、2.000mg·L-1兩實驗組別中GSH的活力下降程度大于0.785mg·L-1的實驗組；當實驗周期達到72h時，0.785mg·L-1的實驗組的GSH活力才開始大幅度的下降，并最終保持穩(wěn)定狀態(tài)。</p><p>　　圖2 NH4Cl對日本沼蝦鰓組織GSH活力的影響</p><p>　　Figure 2 o

44、f NH4Cl vitality of the Japanese marsh shrimp gill tissue GSH</p><p>　　圖3 NH4Cl對日本沼蝦鰓組織CAT活力的影響</p><p>　　Figure 3 of NH4Cl on the Japanese marsh shrimp gill tissue CAT activity</p><p&

45、gt;　　圖4 NH4Cl對日本沼蝦鰓組織GSH活力的影響</p><p>　　Figure 4 of NH4Cl vitality of the Japanese marsh shrimp gill tissue GSH</p><p><b>　　6.討論</b></p><p>　　6.1日本沼蝦對NH4Cl的耐受響應特征</p&

46、gt;<p>　　根據對本實驗的研究及相關文獻的查閱，將氨氮對不同蝦類各觀測時刻的半致死濃度列于表4。從表4可知，日本沼蝦在第72h或第96h的氨氮LC50均低于克氏原鰲蝦 、澳大利亞紅螯螯蝦 、脊尾白蝦幼體 ，中國對蝦 、羅氏沼蝦Z5幼體等，說明了日本沼蝦對氨氮的耐受范圍比上述的其他蝦類的要狹窄。但是，氨氮可導致中國對蝦蝦幼體,生長減緩, 耗氧量增加、蛻皮次數增多；使羅氏沼蝦幼體變態(tài)時間延長、存活率降低；抑制脊尾白蝦糠蝦

47、幼體生長代謝等，所以，在日本沼蝦養(yǎng)殖生產中應密切關注養(yǎng)殖水體中氨氮的變化，并要及時調整水質。</p><p>　　表4 不同蝦類的氨氮半致死質量濃度</p><p>　　Table 4 shrimp ammonia semi-lethal concentrations</p><p>　　6.2日本沼蝦的NH4Cl安全濃度的確定</p><p&g

48、t;　　由表2可知， NH4Cl對日本沼蝦的96h LC50為4.712±0.340 mg.L-1，通過公式SC=0.1×96hLC50，算得其安全濃度的估計值為0.471 mg.L-1。由表3可知，當NH4Cl質量濃度小于等于0.785 mg.L-1時，日本沼蝦的日均呼吸耗氧率和夜均呼吸耗氧率均顯著高于對照組，而當NH4Cl質量濃度為0.942 mg.L-1時，其日均呼吸耗氧率與對照組無顯著差異，而夜均呼吸耗氧率卻

49、明顯低于對照組；說明0.785 mg.L-1為日本沼蝦呼吸耗氧的安全質量濃度的臨界點。由圖2，當NH4Cl質量濃度小于等于0.471 mg.L-1時其鰓組織CAT活力均穩(wěn)定地高于對照組，而當質量濃度為0.628 mg.L-1、0.785 mg.L-1時雖48h內的CAT活力高于對照組，并在72h時與對照組持平，但96h時低于對照組，表明0.471 mg.L-1為日本沼蝦鰓組織CAT酶的安全質量濃度臨界點；同理圖3中，0.628mg.L-

50、1為日本沼蝦鰓組織GSH酶的安全質量濃度臨界點。綜上所述，0.471 mg.L-1為日本沼蝦的安全質量濃度。</p><p><b>　　小結</b></p><p>　　該實驗主要是利用日本沼蝦在逆境脅迫下的耐受能力與響應特征而展開的生物學研究。結合了蝦類生活史的特殊性（出現多次蛻皮現象）以及其在不同條件下對同一生態(tài)因子也不盡相同這一情況而進行的實驗研究，經預備試驗

51、，通過NH4Cl對日本沼蝦的急性毒性實驗，并以此為基礎測定呼吸耗氧率、鰓組織抗氧化酶（CAT、GSH）的活力，然后經過對實驗結果數據的記錄、處理、分析，從而確定NH4Cl對日本沼蝦的安全濃度，以期為日本沼蝦的生態(tài)安全養(yǎng)殖和相關漁損污染事故處理提供科學依據，進而提高在水產養(yǎng)殖領域的安全性、科學性和可靠性。</p><p>　　通過實驗結果的具體整理和綜合分析可知，氯化銨對日本沼蝦的存活、呼吸耗氧率以及抗氧化酶（CA

52、T、GSH）的活力都有顯著影響；同時，根據上述實驗數據的計算分析，得到了氯化銨對日本沼蝦的安全養(yǎng)殖范圍濃度為0.471 mg.L-1。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本論文是在我的導師的悉心指導和耐心幫助下順利完成的，感謝王老師；同時，在這里也得感謝我的同學任、楊和何的參與和幫助，他們在我的論文實驗工作和論文設計寫作過程中給予了許多指導

53、！另外，也感謝在我的論文實驗和寫作過程中給我提供熱忱幫助的各位老師和同學！</p><p><b>　　[參考文獻]</b></p><p>　　[1] 孫振中,劉淑梅,戚雋淵等. 非離子氨氮對羅氏沼蝦幼體的毒性研究[J]. 水產科技情報,1999,(4)：7.</p><p>　　[2] 洪美玲. 水中亞硝酸鹽和氨氮對中華絨螯蟹幼體的毒性效應

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