硒對金屬硫蛋白的誘導(dǎo)表達及對肝纖維化的防護作用研究.pdf

1、肝纖維化是一切慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)途徑，早期診斷與治療可逆轉(zhuǎn)恢復(fù)。本課題組一直致力于研究硒對金屬硫蛋白的誘導(dǎo)表達及其抗纖維化作用，結(jié)果證實有機硒(Org-Se)不僅可明顯誘導(dǎo)金屬硫蛋白(MT)的表達，同時具有一定的肝纖維化防護作用。 目的:評價硒對MT的誘導(dǎo)作用；提取、分離、純化、鑒定Org-Se和鋅(Zn)誘導(dǎo)的MT-1／-2亞型，探討Se代MT存在的可能性。建立纖維化動物模型及血清和組織的蛋白質(zhì)指紋圖譜，并將損傷標志物

2、用于Se代MT對肝損傷防護作用的評價；觀察Org-Se臨床抗纖維化療效，建立肝纖維化病人蛋白質(zhì)表達指紋圖譜，尋找標志物，為臨床肝纖維化無創(chuàng)性早期和分級診斷提供新的技術(shù)平臺。 方法:(1)利用表面加強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)、RT-PCR等技術(shù)從蛋白表達及轉(zhuǎn)錄水平上對比了Org-Se與Zn對MT的誘導(dǎo)作用；利用凝膠層析、離子交換層析提取分離了Zn-MT-1/-2及Se代MT-1/-2，應(yīng)用SDS-PAG

3、E、MALDI-TOF-MS等實驗技術(shù)手段測定和驗證Zn-MT-1/-2和Se代MT-l/-2純度及分子量。運用ICP-MS對比分析了Zn-MT和Se代MT中C、H、N、S、Se的含量。(2)利用酒精和CCh建立大、小鼠肝纖維化模型，通過血清、組織生化指標、病理切片觀察及蛋白質(zhì)指紋圖譜的建立，動態(tài)觀察損傷過程，捕捉損傷蛋白標志物，觀察Org-Se對纖維化或損傷的防護作用。(3)在浙江和山東兩地跟蹤隨訪肝病患者26例，觀察服用Org-Se

4、6個月后的臨床療效，分析肝功能及肝纖維化指標的變化，確定用藥后纖維化改善情況；利用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)建立肝纖維化不同分級病人及肝硬化病人的蛋白表達指紋圖譜，獲取蛋白標志物。 結(jié)果:(1)Org-Se對小鼠肝臟MT的誘導(dǎo)表達高于Na2Se03和ZnS04；經(jīng)DNA回收測序鑒定，Org-Se誘導(dǎo)的MT序列與基因庫中完全匹配，同時發(fā)現(xiàn)Org-Se在轉(zhuǎn)錄水平上對MT-2的誘導(dǎo)高于Zn對MT-2的誘導(dǎo)，但對MT-1基因水平的誘導(dǎo)與Z

5、n的作用相似，進一步證明Org-Se為MT高效誘導(dǎo)劑。經(jīng)凝膠層析和離子交換層析，得到Zn-MT-1／-2和Se代MT-l／-2。凝膠電泳驗證Zn-MT-1／-2條帶單一，分子量測定Zn-MT-1分子量為5915Da～6242Da、7929Da及¨840Da、15818Da，有聚合現(xiàn)象；Zn-MT-2分子量為6058Da，與文獻報道相符。Se代MT-1分子量為5915Da～6242Da及7929Da，未見Zn—MT-l所出現(xiàn)的明顯聚合現(xiàn)象

6、，蛋白電泳在6．5kD處呈現(xiàn)一條主要的條帶；Se代MT一2分子量在6124Da～6243Da，蛋白電泳結(jié)果理想呈現(xiàn)單一條帶。Se代MT-1分子量與Zn-MT-1分子量相似，而Se代MT-2分子量則高于Zn-MT-2分子量，明顯出現(xiàn)右移，同時ICP-MS結(jié)果顯示Se代MT中Se含量明顯上升，而S含量明顯下降，這提示Se可能參與了MT的合成。(2)通過蛋白質(zhì)指紋圖譜捕獲到小鼠肝纖維化血清蛋白標志物分別為5．0kD、5．5kD、6．3kD，組

7、織蛋白標志物為5．4kD、7．1kD、9．9kD和10．1kD；大鼠酒精性肝損傷血清蛋白標志物為7．0kD、8．3kD、¨．6kD和14．0kD，組織蛋白標志物為5．9kD和7．1kD；結(jié)合各項生化指標、病理圖片及蛋白標志物綜合分析，發(fā)現(xiàn)提前給予Org-Se的預(yù)先保護組各項指標均優(yōu)于損傷組，顯示Org-Se在誘導(dǎo)MT表達的基礎(chǔ)上對肝纖維化及肝損傷具有明顯的保護作用。(3)通過26例不同程度肝纖維化患者服用Org-Se，對比用藥前后肝功能

8、和肝纖維指標，經(jīng)統(tǒng)計分析，肝功能指標中球蛋白(GLB)含量與用藥前相比有顯著性差異，肝纖維化指標中透明質(zhì)酸(HA)和III型原膠原(PCⅢ)與用藥前相比有顯著性差異；在對不同纖維化分級的病人進行蛋白質(zhì)圖譜分析時發(fā)現(xiàn)了一個特異表達的蛋白標志物，其質(zhì)荷比為8．9kD，這一發(fā)現(xiàn)為進一步研究肝纖維臨床意義重大，為肝纖維化無創(chuàng)診斷提供了新的契機，目前這一發(fā)現(xiàn)還需進一步擴大臨床試驗進行論證。 討論:(1)從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達兩方面證實了S

9、e對肝臟MT的誘導(dǎo)作用，目前尚未見報道。Org-Se具有明顯的MT誘導(dǎo)作用，可以作為MT高效安全的誘導(dǎo)劑，是Se生物學(xué)功能的又一體現(xiàn)，并拓展了MT在未來基礎(chǔ)和臨床研究中的應(yīng)用范圍。(2)提純了Org-Se誘導(dǎo)的小鼠肝臟MT-1／-2亞型，及Zn誘導(dǎo)的MT-1／-2亞型，并從分子量鑒定中發(fā)現(xiàn)Org-Se誘導(dǎo)的小鼠肝臟MT-2亞型較Zn誘導(dǎo)的小鼠肝臟MT-2亞型在分子量上的變化，另外元素分析顯示了Se元素在Org-Se代MT中含量的升高和S