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文檔簡介
1、過敏性哮喘是以氣道高反應性(airwayhypersensitivity,AHR)、嗜酸性粒細胞和Th2細胞過度浸潤以及血清高水平IgE為特征的慢性氣道變應性炎癥性疾病。目前研究認為,T淋巴細胞優(yōu)勢性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2類細胞因子在過敏性哮喘的引發(fā)中扮演著重要角色。
Cd3001f(CD300antigenlikefamilymemberF)分子是一個氨基端帶有信號肽、胞外段帶有IgV樣結構域、跨膜區(qū)
2、、胞內段帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(immune-receptortyrosine-basedinhibitorymotifs,ITIM)和免疫受體酪氨酸轉化基序(immune-receptortyrosine-basedswitchingmotif,ITSM)的I型糖蛋白,有研究顯示,阻斷或沉默樹突狀細胞表面Cd3001f分子的表達能夠促進樹突狀細胞啟動的T細胞增殖以及抗原特異性T細胞應答,表明Cd3001f分子具有負向調控樹突狀細胞
3、啟動T細胞應答的功能。
在本研究中,我們根據(jù)GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM145634.3),設計含完整開放閱讀框(openreadingframe,ORF)的Cd3001f基因特異性引物,采用反轉錄聚合酶鏈式反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)從小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bonemarrow-deriveddendritic
4、cells,BMDCs)中擴增得到Cd3001f基因,將其與pMD-18T載體連接構建重組質粒pMD-Cd3001f。經(jīng)生物信息學分后,設計特異性引物以重組質粒pMD-Cd3001f為模板聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)擴增Cd3001f基因編碼區(qū)不合信號肽的胞外段,將其與pGEX-4T-3載體連接構建原核表達質粒pGEX-Cd3001f(22aa-185aa)。原核表達質粒載體轉化大腸桿菌Ros
5、etta(E3)后,經(jīng)IPTG誘導表達了約45.5kD的GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后皮下免疫接種新西蘭大白兔,制備了抗GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)結果顯示,其抗體效價高達1:16384。將Cd3001f基因真核表達質粒轉染人胚胎腎細胞(h
6、umanembryonickidney293cells,HEK293),間接免疫熒光實驗(indirectimmunofluorescenceassays,IIFA)和免疫印跡實驗(Westernblot)檢測兔抗GST-Cd3001f(22-185aa)融合蛋白多克隆抗體的特異性。結果顯示,該多克隆抗體能夠特異性的識別Cd3001f真核表達蛋白。
根據(jù)siRNA設計原則,設計5對小鼠Cd3001f基因保守序列編碼短發(fā)卡R
7、NA(shorthairpinRNA,shRNA)的正義、反義寡核苷酸鏈,將其退火后分別克隆至pLL3.7質粒載體中獲得Cd3001f基因shRNA表達質粒。采用脂質體法,分別將Cd3001f基因shRNA表達質粒與Cd3001f基因真核表達質粒pCDNA-Cd3001f共轉染HEK293細胞48小時。Real-timePCR分析顯示,重組質粒pLL-Cd3001f-shRNAe對Cd3001f基因mRNA抑制率為75.6%。以重組質粒
8、pMD18-Cd3001f為模板PCR擴增Cd3001f基因,將其插入穿梭質粒pAdTrack-CMV中。以重組質粒pLL-Cd3001f-shRNAe為模板PCR擴增含U6啟動子的Cd3001f基因shRNA,將其插入穿梭質粒pAdTrack中。PmeⅠ酶切陽性重組質粒后轉化含重組腺病毒骨架質粒Adeasy-1的感受態(tài)菌BJ5183,進行同源重組。PacⅠ酶切重組腺病毒載體后,脂質體法轉染HEK293細胞。轉染后12-18天,獲得重組
9、腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量擴增重組腺病毒,并采用CsCl密度梯度離心法進行純化。重組腺病毒Ad-Cd3001f滴度為1.4×109PFU/ml,Ad-Cd3001f-shRNA滴度為2.6×109PFU/ml。以感染復數(shù)(amultiplicityofinfection,MOI)為75的重組腺病毒感染BMDCs48小時。Real-timePCR分析顯示,Ad-Cd3001f感染細胞中Cd3001f
10、基因mRNA的表達水平顯著升高,而Ad-Cd3001f-shRNA感染細胞中Cd3001f基因mRNA表達水平下降達51.7%。Westernblot分析顯示,Ad-Cd3001f感染細胞特異性地表達了Cd3001f蛋白。
分別于第0天、第14天給C57BL/6小鼠腹腔注射經(jīng)凝膠佐劑乳化的卵清白蛋白(ovalbumin,OVA),第二次致敏后10天OVA溶液連續(xù)激發(fā)3天。以MOI為75的重組腺病毒Ad-Cd3001f(DC
11、-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA(DC-siCd3001f)分別感染培養(yǎng)5天的BMDCs24小時,再用OVA激發(fā)24小時。分別于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激發(fā)后24小時,檢測氣道高反應性。吉姆薩瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性細胞分類計數(shù)。H&E和PAS染色觀察肺組織病理學變化。ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage
12、fluid,BALF)、脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。流式細胞術檢測脾細胞中CD4+Foxp3+Tregs和CD4+IL-17A+Th17的百分比。研究結果顯示,DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能夠減輕氣道高反應性和肺組織炎癥,降低肺泡灌洗液和脾細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌,提高脾細胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比,降低脾細胞中CD4+IL-17A+Th17的百分
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