間皮素小干擾RNA對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞生長特性以及粘附侵襲遷移功能的影響.pdf

1、目的：間皮素(MSLN)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤分化抗原，通常表達(dá)在胸膜、腹膜和心包的正常間皮細(xì)胞，但在惡性間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)。MSLN的前體蛋白可被furin蛋白酶水解為Mr分別為40kDa和31kDa的兩個(gè)片段，其中40kDa的片段通過糖基磷脂酰肌醇與胞膜相連，稱之為間皮素(MSLN)；31kDa.的片段脫落，稱為巨核細(xì)胞集落刺激因子(MPF)。應(yīng)用cDNA微陣列方法分析卵巢上皮性癌(EOC)和正常卵巢組織的基因

2、表達(dá)譜，結(jié)果顯示具有潛在生物學(xué)標(biāo)記的MSLN顯著上調(diào)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)CA125與膜連接蛋白間皮素之間以某種特殊的方式結(jié)合，兩者的相互作用介導(dǎo)了細(xì)胞之間的粘附，可能與卵巢上皮性癌細(xì)胞的腹腔種植，最終導(dǎo)致廣泛轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MSLN可能是一種很有前途的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但迄今為止MSLN的功能研究還僅僅限于細(xì)胞粘附方面，對(duì)其他方面的功能了解甚少。 利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)方法，可以長期沉默靶細(xì)胞的基因表達(dá)，用于基因功能

3、研究和基因治療等方面。本課題組前期研究構(gòu)建了間皮素RNA干擾重組慢病毒質(zhì)粒載體，制備的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定證明重組成功，并包裝出病毒顆粒，測(cè)定的病毒顆粒符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求?；诖?，本研究利用RNAi技術(shù)對(duì)MSLN基因表達(dá)進(jìn)行抑制以達(dá)到治療腫瘤的目的，進(jìn)行了以下研究。 方法： 1.分別用攜帶pMSLN-negative、pMSLN-shRNA1、pMSLN-shRNA2、pMSLN-shRNA3、pMSLN-shRNA4

4、質(zhì)粒的慢病毒液感染SKOV-3細(xì)胞96小時(shí)后，激光共聚焦顯微鏡下觀察感染效率。 2.利用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中間皮素蛋白的表達(dá)，選擇干擾效率高的shRNA4序列細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3.應(yīng)用間接免疫熒光染色法檢測(cè)重組慢病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)間皮素蛋白表達(dá)定位的影響。 4.應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成的方法檢測(cè)間皮素低表達(dá)細(xì)胞的增殖力變化。 5.EDTA介導(dǎo)的細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

5、間皮素低表達(dá)細(xì)胞體外粘附能力的變化。 6.細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)間皮素低表達(dá)侵襲能力的變化。 結(jié)果： 1.慢病毒感染SKOV-3細(xì)胞96小時(shí)后，激光共聚焦顯微鏡下觀察感染細(xì)胞中熒光細(xì)胞的數(shù)量，說明感染效率為80％-90％。 2.Western blotting結(jié)果顯示，與OVCAR-3細(xì)胞相比，OVCAR-3/neg以及OVCAR-3/(shRNA1～shRNA4)的蛋白表達(dá)分別下調(diào)了10％、9％、53％

6、、84％、90％，其中OVCAR-3/shRNA4的干擾效率最高為：90％。 3.MSLN在SKOV-3細(xì)胞的定位表達(dá)，可見MSLN蛋白標(biāo)記為紅色熒光，主要分布在細(xì)胞膜，SKOV-3/shRNA組的MSLN蛋白熒光強(qiáng)度明顯低于SKOV-3、SKOV-3/neg兩組。 4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組(SKOV-3/shRNA)，陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)和空白對(duì)照組(SKOV-3)的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(9.89±2.

7、0)×105，(18.9±2.24)×105，(19.81±2.5)×105，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.76)。干擾組細(xì)胞增殖速度顯著慢于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間增殖速度無明顯差別?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾組(SKOV-3/shRNA)克隆形成率為(15.85±2.5)％，陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)為(28.3±2.7)％和空白對(duì)照組(SKOV-3)為(29.13±1.98)％，結(jié)果比較差異

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.62)。干擾組細(xì)胞克隆形成率明顯低于其他兩組，陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)和空白對(duì)照組(SKOV-3)之間克隆形成率無明顯差別。 5.細(xì)胞黏附能力的測(cè)定EDTA介導(dǎo)的細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)：干擾組(SKOV-3/shRNA)各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的脫壁率(13.86±1.05)％，(34.44±2.72)％，(56.71±3.4)％，(83.76±4.37)％顯著高于陰性對(duì)照組(8.32±1.1)％，(20.04±1.8

9、8)％，(33.07±2.52)％，(42.73±3.61)％和空白對(duì)照組(9.28±0.95)％，(18.12±0.85)％，(29.97±2.15)％，(40.43±2.66)％，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間無明顯差別。 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果：干擾組(SKOV-3/shRNA)、陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)和空白對(duì)照組(SKOV-3)的粘附率分別為(12.12±2.21)％，(49.78±3.2)％及(50.74±2.65)

10、％，結(jié)果分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=327.87)，干擾組(SKOV-3/shRNA)的粘附率顯著低于陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)和空白對(duì)照組(SKOV-3)。陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)和空白對(duì)照組(SKOV-3)的粘附率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.間皮素表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，干擾組(SKOV-3/shRNA)、陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)以及空白對(duì)照組(SKOV-3)轉(zhuǎn)入底層膜的細(xì)胞數(shù)分別

11、為(7.5±1.78)個(gè)、(27.54±3.39)個(gè)、(29±2.29)個(gè)，結(jié)果分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=208.96，P<0.05)。干擾組細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，空白對(duì)照組(SKOV-3)和陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組遷移到濾膜下面的細(xì)胞數(shù)，干擾組為(18.7±2.11)個(gè)，陰性對(duì)照組為(44.7±4.57)個(gè)，空白對(duì)照組為(47±4.14)個(gè)，結(jié)果

12、分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=174.51)。干擾組細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空白對(duì)照組(SKOV-3)和陰性對(duì)照組(SKOV-3/neg)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.病毒載體系統(tǒng)能有效的把目的基因整合至靶細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，并有較高的轉(zhuǎn)染效率。 2.通過Western blotting檢測(cè)證實(shí)MSLN-RNAi能有效抑制MSLN蛋白的表達(dá)，同時(shí)干擾后細(xì)胞生長特性發(fā)生改變，說明M