亞甲蘭光化學(xué)法滅活血漿乙肝病毒及對紅細(xì)胞膜的損傷研究.pdf

1、目的：研究不同濃度的MB(1.0μmol/L，5.0pmol/L，10.0μmol/L)，在光照度為40000LUX，分別熒光照射血漿0、20、40、60min，滅活血漿病毒DNA，通過熒光定量PCR技術(shù)對血漿病毒滅活的各個(gè)不同時(shí)間段乙肝病毒DNA濃度進(jìn)行監(jiān)測，判斷滅活效果，選定最佳滅活條件，并觀察病毒滅活后對血漿成分的影響。研究5.0μmol/L的MB濃度，在光照度為40000LUX，分別照射紅細(xì)胞懸液0、20、40、60min，觀察

2、MB法處理懸液的同時(shí)膜的損傷程度，間接了解對紅細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，探討亞甲藍(lán)光化學(xué)法在紅細(xì)胞制品病毒滅活方面的可行性。 方法：在己知HBV-DNA陽性血漿中加入MB，調(diào)整MB終濃度分別為1.0μmol/l、5.0μmol/l、10.0μmol/l，光照度為40000LUX，照射時(shí)間分別為0min、20min、40min、60 min，在各點(diǎn)分別取樣抽提基因組DNA用于熒光定量分析，測定HBV-DNA的濃度，推斷在不同時(shí)間和濃度

3、下的滅活效果。在滅活效果最好的點(diǎn)取樣檢測血漿正常成分有無顯著變化，其中包括生化指標(biāo)，酶學(xué)指標(biāo)，凝血因子FⅧ：C活性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白亞基的變化，蛋白免疫印跡觀察血漿的抗體蛋白活性變化。同樣方法，亞甲藍(lán)光化學(xué)法處理紅細(xì)胞懸液，光照度為40000LUX，MB濃度為5.0μmol/L，在光照0min、20min、40min、60 min后的不同時(shí)間點(diǎn)提膜測定紅細(xì)胞膜Na+-K+ATP酶，膜AchE活性，并觀察紅細(xì)胞形態(tài)的變化及

4、膜的通透性改變。 結(jié)果：當(dāng)MB為10.0μmol/L，光照60min時(shí)，滅活乙肝病毒的效果最好，對于高拷貝數(shù)的病毒濃度，在本實(shí)驗(yàn)的條件下，尚無法完全滅活病毒，但可以使HBV-DNA濃度明顯下降；從病毒滅活的表格看，滅活效果與時(shí)間和MB濃度呈正相關(guān)，作用60min時(shí)血漿中主要成分的生化指標(biāo)無顯著變化及凝血因子FⅧ：C活性無明顯改變，部分血漿酶活性有明顯下降(P＜0.05)。血漿蛋白的亞基數(shù)目和遷移速度未見明顯變化，血漿的抗體蛋白也

5、具有正常的生物學(xué)活性。在用于紅細(xì)胞制品滅活方面，亞甲藍(lán)法還有缺陷，對紅細(xì)胞膜的損傷較明顯。隨著照射時(shí)間的延長，紅細(xì)胞的邊緣出現(xiàn)了不規(guī)則、粘連，附著物也逐漸增多。紅細(xì)胞的溶血度顯著增大(P＜0.05)，幾乎呈線性。在照射過程中，Na+-K+ATP酶無明顯下降。膜AchE在40min后下降速率增大，與對照組比，下降了大約65％(P＜0.05)。在照射20min后滲透脆性也漸出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)。推測亞甲藍(lán)對膜損傷的主要機(jī)制可能是單線