新型抗結(jié)核藥靶TPP和LipF的功能分析及先導(dǎo)化合物的初步篩選.pdf

1、結(jié)核病是全球死亡率和發(fā)病率最高的傳染性疾病之一，每年可以引起8百萬人感染，導(dǎo)致2.5-3百萬人死亡。結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的主要病原。全球耐多藥結(jié)核菌的出現(xiàn)和蔓延，對發(fā)展新型的抗結(jié)核藥物提出了迫切需求。 結(jié)核分枝桿菌的細胞壁成份獨特，也是目前一些一線抗結(jié)核藥物的作用靶點。因而結(jié)核分枝桿菌細胞壁合成途徑可以作為設(shè)計抗結(jié)核藥物的合適靶點。本論文選取結(jié)核分枝桿菌細胞壁合成的必需蛋白——海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)為研究對象。①首先

2、克隆了TPP的編碼基因 DtsB2/Rv3372,然后在大腸桿菌中表達并純化TPP，生化驗證了重組酶具有海藻糖磷酸磷酸酶活性；②制備了兔抗TPP血清，并通過差速離心和免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)TPP亞細胞定位于結(jié)核分枝桿菌和BCG的細胞壁和細胞膜上；③兔抗TPP血清能體外抑制結(jié)核分枝桿菌的增值；④TPP能誘導(dǎo)巨噬細胞的吞噬功能，刺激巨噬細胞增值，并能引起小鼠Th1型免疫反應(yīng)，⑤用BCG尾靜脈注射C57BL/6小鼠4周后，BCG在TPP免疫小鼠的脾

3、臟和肺中的CFU值比未免疫小鼠的高。由于在人和哺乳動物體內(nèi)沒有TPP的同源蛋白，并且TPP編碼基因otsB2/Rv3373是結(jié)核生長必需的，所以將TPP作為抗結(jié)核候選藥靶。⑥采用同源模建的方法進行了TPP的三維結(jié)構(gòu)模擬，分析TPP酶活性中心是Asp147、Asp330、Asp331和Asp3341；⑦通過基因定點突變，分別獲得了各個活性位點突變?yōu)锳la的的蛋白，突變蛋白幾乎喪失海藻糖磷酸磷酸酶的活性；⑧從Tripos化合物數(shù)據(jù)庫中虛擬篩

4、選到55種能與TPP活性位點結(jié)合的小分子化合物；⑨通過酶活性檢測，分析了化合物對TPP活性的抑制作用；⑩體外篩選到有效抑制結(jié)核分枝桿菌H37Rv的先導(dǎo)化合物3種，其中能夠抑制臨床多耐藥結(jié)核菌的先導(dǎo)化合物2種。 本論文另一個研究對象是結(jié)核分枝桿菌酯酶F(lipF，Rv3487c)。①LipF受酸性條件的誘導(dǎo)；②重組酶具有降解短鏈脂肪酸的活性。由于LipF與人和哺乳動物體內(nèi)脂酶的同源性低，并且與結(jié)核的致病性相關(guān)，所以將LipF作為抗