洛鉑及IL-2聯(lián)合干預(yù)對乳腺癌細(xì)胞Syk、C-myc及p53表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害廣大女性的身心健康。洛鉑是第三代鉑類抗癌藥物，其抗癌治療指數(shù)高于順鉑和卡鉑，對一部分順鉑和卡鉑耐藥的腫瘤患者有效，且毒副作用比順鉑、卡鉑等藥物均低。目前，洛鉑常被用于治療乳腺癌和小細(xì)胞肺癌等，但作用機(jī)制尚不十分清楚。IL-2作為增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物，能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。洛鉑和IL-2聯(lián)合用藥是臨床治療乳腺癌的一個(gè)新方案。但I(xiàn)L-2對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的作用研究還不多，

2、結(jié)論不明確。本研究探討了IL-2、洛鉑以及洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231體外增殖的抑制作用，以及對乳腺癌細(xì)胞內(nèi)p53、syk和c-myc基因表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1細(xì)胞株及其培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231用含10％胎牛血清、100mg/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2細(xì)胞增殖試驗(yàn)取

3、對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組如下，不同濃度洛鉑（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml）、IL-2（3125、6250、12500、25000、50000、100000IU/ml）、IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μg/ml），計(jì)算不同劑量藥物對細(xì)胞的增殖抑制率。
　　 3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化取對

4、數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對象，分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組如下，不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml）、IL-2（25000、100000IU/ml）和IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml），以及對照組，把不同實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的細(xì)胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 4細(xì)胞凋亡的檢測收集經(jīng)不同濃度洛鉑（1.25、5.00、1

5、0.00μg/ml）、IL-2（25000、50000、100000IU/ml）和IL-2（25000IU/ml）聯(lián)合不同濃度洛鉑（1.25、5.00、10.00μg/ml）作用24小時(shí)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，流式細(xì)胞儀檢測，Single histogram statistic軟件分析細(xì)胞凋亡率。
　　 5半定量RT-PCR技術(shù)檢測MCF-7和MDA-MB

6、-231細(xì)胞syk、p53、c-myc mRNA表達(dá)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度洛鉑、IL-2和IL-2聯(lián)合不同濃度洛鉑（濃度分組同上4）作用24小時(shí)，用Trizol試劑法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），分析Syk、p53、c-myc、β-actin mRNA表達(dá)。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本組間均數(shù)比較用t

7、檢驗(yàn)，多組的組間比較用方差分析，p<0.05表示差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1洛鉑對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖有明顯抑制作用當(dāng)濃度范圍在1.25～20.00μg/ml時(shí)，洛鉑能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖反應(yīng)，呈現(xiàn)量效和時(shí)效關(guān)系（p<0.05），其中20μg/ml洛鉑對MCF-7和MDA-MB-231作用72小時(shí)的抑制率分別為63.69％和76.00％。
　　 2 I

8、L-2對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖有抑制作用當(dāng)劑量范圍為3125～100000IU/ml時(shí)， IL-2對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖抑制作用也呈現(xiàn)量效和時(shí)效關(guān)系（p<0.05），其中100000IU/ml IL-2作用72小時(shí)對MCF-7和MDA-MB-231的抑制率分別為34.03％和19.57％。
　　 3洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7和MDA－MB－231細(xì)胞增殖抑制率比單用洛鉑高聯(lián)合應(yīng)

9、用中相同劑量洛鉑和相同作用時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率較單獨(dú)應(yīng)用洛鉑時(shí)增強(qiáng)（p<0.05）。其中20.00μg/ml洛鉑與25000 IU/ml IL-2聯(lián)合作用72小時(shí)，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率分別為79.00％和82.29％，而單獨(dú)應(yīng)用洛鉑的細(xì)胞增殖抑制率分別為63.69％和76.00％。
　　 4 IL-2處理組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)無明顯改變?nèi)鹗?姬姆薩染色染色結(jié)果顯示，25000IU

10、/ml IL-2處理24小時(shí)后，MCF-7和MDA-MB-231無明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　 5洛鉑處理組和聯(lián)合處理組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)凋亡前期的形態(tài)學(xué)改變?nèi)鹗?姬姆薩染色染色結(jié)果顯示，1.25μg/ml洛鉑處理24小時(shí)后或1.25μg/ml洛鉑和25000IU/ml IL-2聯(lián)合作用后，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)均呈現(xiàn)凋亡前期形態(tài)學(xué)改變。
　　 6洛鉑能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-

11、231細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞，1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml單獨(dú)洛鉑作用24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為18.40％、21.49％、31.57％。對于MDA-MB-231細(xì)胞，1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml單獨(dú)洛鉑作用24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為6.15％、16.33％、20.39％?？梢婋S著洛鉑濃度的增高，兩種細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)升高趨勢。
　　 7 I

12、L-2不能誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，25000IU/ml、50000IU/ml、100000IU/ml單獨(dú)IL-2作用24小時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為3.79％、2.43％、3.31％，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別為7.55％、8.96％、9.64％。與對照組（MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分別為2.91％和8.67％）比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 8洛鉑和I

13、L-2聯(lián)合應(yīng)用與單用洛鉑組比較，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率有所增加當(dāng)25000IU/ml IL-2分別與1.25μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml洛鉑聯(lián)合作用24小時(shí)后，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為27.01％、34.84％、40.86％，MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率分別為6.83％、19.30％、25.48％，與相同濃度單用洛鉑組細(xì)胞凋亡率比較有所增加（p<0.05）。
　　 9洛鉑或IL-2

14、，以及兩種聯(lián)合作用對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞syk、c-myc、p53 mRNA表達(dá)的影響不一半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞，在單獨(dú)應(yīng)用不同濃度洛鉑（5.00μg/ml、10.00μg/ml）和單獨(dú)應(yīng)用IL-2（25000IU/ml、50000IU/ml、100000IU/ml）時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞p53、c-myc、syk mRNA表達(dá)水平與對未處理組相比均有所降低（p<0.05）；而當(dāng)不同濃度洛鉑與25

15、000IU/ml IL-2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p53、syk、c-myc mRNA的表達(dá)水平與未處理組相比則無顯著性差異（p>0.05）。
　　 對于MDA-MB-231細(xì)胞，在各不同處理組或?qū)φ战M中均未檢出syk mRNA的表達(dá)。在單獨(dú)應(yīng)用不同濃度洛鉑和單獨(dú)應(yīng)用不同濃度IL-2時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p53mRNA表達(dá)水平均高于對照組細(xì)胞，比較有顯著性差異（p<0.05），同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞c-myc mRNA表達(dá)水平均低于對照組細(xì)

16、胞，比較有顯著性差異（p<0.05）。當(dāng)不同濃度洛鉑與25000IU/ml IL-2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中p53、c-myc mRNA表達(dá)變化不同，與未處理組相比有顯著性差異（p<0.05），而與相同濃度單獨(dú)應(yīng)用洛鉑實(shí)驗(yàn)組比較無顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1在體外洛鉑能明顯抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，且具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2在體外IL-2對

17、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖有抑制作用，具有量效和時(shí)效關(guān)系。但不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 3洛鉑和IL-2聯(lián)合應(yīng)用，對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用高于單用洛鉑的作用。并仍能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 4對于MCF-7細(xì)胞，單獨(dú)應(yīng)用洛鉑或IL-2能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53、syk、c-myc mRNA的表達(dá)。而當(dāng)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)三種不同基因表達(dá)水平無明顯下降。
　　 5對于MDA-MB-231細(xì)