過(guò)氧亞硝酸根對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用及其機(jī)理.pdf

1、糖尿病是一種常見(jiàn)的易發(fā)性代謝疾病，其中90%以上為2型糖尿病。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征，其本質(zhì)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)故障。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，活性氧和活性氮介導(dǎo)糖尿病及其并發(fā)癥的病理過(guò)程。氧化應(yīng)激狀態(tài)下NO衍生得到的ONOO-是一個(gè)強(qiáng)氧化劑和硝化劑，可與多種生物大分子反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)修飾。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它與炎癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種病癥相關(guān)，

2、而ONOO-路徑是導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的重要途徑。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化能影響蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化，從而影響酪氨酸磷酸化介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明ONOO-與胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但ONOO-對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用及其機(jī)理尚不完全清楚。
　　 本論文從體外化學(xué)體系、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)方面入手，以純化胰島素受體、HepG2細(xì)胞和原代骨骼肌細(xì)胞、2型糖尿病小鼠模型為研究對(duì)象，探討了ONOOˉ對(duì)胰島素

3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用及其機(jī)理，所取得的主要結(jié)果有：
　　 (1)ONOO-對(duì)骨骼肌細(xì)胞中胰島素信號(hào)分子基因表達(dá)的影響
　　 以原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究了化學(xué)合成ONOO-和SIN-1對(duì)IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cbl通路中信號(hào)分子基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，50-1000 μM的ONOOˉ處理顯著減少了骨骼肌細(xì)胞中IR、IRS-1、CAP、Cbl和Glu

4、t4的基因表達(dá)水平，并具有濃度依賴(lài)性。而且，SIN-1濃度依賴(lài)地減少了骨骼肌細(xì)胞中IR、Cbl和Glut4的基因表達(dá)水平，對(duì)IRS-1、CAP、p85α和SHIP2的基因表達(dá)水平則具有雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度下表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度下表現(xiàn)為抑制作用。以上結(jié)果表明較高濃度的ONOOˉ可能下調(diào)IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cbl通路中信號(hào)分子的基因表達(dá)水平，從而抑制骨骼肌細(xì)胞中的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 (2)O

5、NOO-對(duì)HepG2細(xì)胞中胰島素磷酸化信號(hào)的影響
　　 以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用亞細(xì)胞分級(jí)和Western Blotting技術(shù)，研究了ONOOˉ引起的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化對(duì)胰島素刺激的酪氨酸磷酸化信號(hào)的影響，以及硝化蛋白和磷酸化蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明ONOOˉ 濃度依賴(lài)性地引起了HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)的硝化，硝化蛋白主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。ONOOˉ在低濃度下(10-50 μM)促進(jìn)膜蛋白和胞質(zhì)蛋白的酪氨酸磷酸化，可能

6、起到信號(hào)分子的作用；在高濃度下(100-200 μM)抑制膜蛋白和胞質(zhì)蛋白的磷酸化，可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)，提示ONOO-對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能具有雙向調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)ONOO-對(duì)胰島素受體自磷酸化和激酶活性的影響
　　 采用免疫沉淀、免疫印跡、放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、小鼠血糖測(cè)定和實(shí)時(shí)定量PCR等方法研究了ONOOˉ 在體外和體內(nèi)對(duì)胰島素受體自磷酸化和激酶活性的影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論在基礎(chǔ)狀態(tài)下還是在胰島

7、素刺激狀態(tài)下，低濃度的ONOOˉ(50 μM)促進(jìn)了胰島素受體的自磷酸化和激酶活性，可能作為一個(gè)信號(hào)分子，而高濃度的ONOOˉ(100-500 μM)抑制了胰島素受體的自磷酸化和激酶活性，可能介導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。ONOOˉ的這種雙向調(diào)節(jié)作用可能與它對(duì)胰島素受體的硝化和氧化修飾有關(guān)。此外，酪氨酸磷酸酯酶活性的降低以及胰島素受體與125I-胰島素結(jié)合能力的降低也參與了這一調(diào)節(jié)過(guò)程。進(jìn)一步的體內(nèi)研究表明，腹腔注射0.1 mg/kg和0.25

8、 mg/kg SIN-1顯著降低了正常小鼠的血糖，其作用機(jī)理與IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高有關(guān)。腹腔注射0.25 mg/kg和0.5 mg/kg SIN-1顯著升高了糖尿病小鼠的血糖，其作用機(jī)理與IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低有關(guān)。以上研究結(jié)果首次闡明了ONOOˉ 在體外和體內(nèi)如何影響胰島素受體功能，提示ONOOˉ對(duì)胰島素受體的自磷酸化和激酶活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。
　　 (4)ONOO-在小鼠骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生中

9、的作用
　　 采用胰島素耐量測(cè)試、免疫沉淀和免疫印跡等方法研究了SIN-1對(duì)正常小鼠胰島素敏感性的影響，以及骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化和磷酸化。采用高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型，檢測(cè)骨骼肌中IR和IRS-1的硝化和磷酸化，并觀(guān)察了ONOOˉ清除劑FeTPPS對(duì)上述效應(yīng)的干預(yù)作用。研究結(jié)果表明，正常小鼠腹腔注射10 mg/kg SIN-1后，與空白對(duì)照組相比胰島素敏感性顯著降低，骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化

10、水平顯著增加，而且在胰島素刺激狀態(tài)下IR、IRS-1和Akt的磷酸化水平顯著降低，這可能是SIN-1導(dǎo)致胰島素敏感性降低的重要原因。此外，SIN-1慢性注射使IRS-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低。在高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠中，與正常對(duì)照組相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平顯著升高，磷酸化水平顯著降低，胰島素敏感性也顯著降低。使用FeTPPS治療后，與高脂飲食組相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平顯著降低，磷酸化水平顯著升高，胰島素敏感

11、性也顯著升高。以上研究結(jié)果提示IR、IRS-1和Akt的硝化是iNOS介導(dǎo)的胰島素抵抗的一種新的機(jī)理。
　　 (5)糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌中硝化蛋白質(zhì)組的初步研究
　　 采用免疫沉淀結(jié)合SDS-PAGE分離、免疫印跡、膠內(nèi)酶切和LC-ESI-MS/MS等方法鑒定了體外硝化BSA的硝化位點(diǎn)，并探討了2型糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌中的蛋白質(zhì)硝化。研究結(jié)果表明，BSA發(fā)生硝化的酪氨酸為T(mén)yr161和Tyr424。與正常小鼠相比，糖