過(guò)氧亞硝酸根對(duì)蛋白質(zhì)中酪氨酸硝化作用及其機(jī)理研究.pdf

1、過(guò)氧亞硝酸根(peroxynitrite,ONOO-)是生物體內(nèi)由一氧化氮(nitric oxide,NO·)和超氧根陰離子(superoxide,O2-·)快速結(jié)合生成的一種生物活性小分子。它具有強(qiáng)氧化和硝化能力,可以造成DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的修飾與損傷,其中ONOO-介導(dǎo)的蛋白質(zhì)酪氨酸殘基硝化可能在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和炎癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用,它可

2、以使蛋白質(zhì)改性,使酶失活或激活,并產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用,包括影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,引起細(xì)胞能量耗竭,導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡、死亡,最終可能引發(fā)疾病。但是,目前有關(guān)ONOO-誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的機(jī)制、硝化的位點(diǎn)及位點(diǎn)選擇性等問(wèn)題尚不明確。本論文從實(shí)驗(yàn)和理論兩方面研究ONOO-介導(dǎo)的酪氨酸硝化及其反應(yīng)機(jī)理,并以胰島素和p16(INK4a)蛋白為對(duì)象,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)方法,研究ONOO-誘導(dǎo)蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的過(guò)程、選擇位點(diǎn)以及硝化過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)

3、構(gòu)的變化。 論文首先研究ONOO-對(duì)酪氨酸的硝化作用及其反應(yīng)機(jī)理。氨基酸是蛋白質(zhì)的物質(zhì)組成,ONOO-對(duì)蛋白質(zhì)的損傷主要通過(guò)其對(duì)側(cè)鏈殘基的修飾表現(xiàn)出來(lái),因此研究ONOO-對(duì)酪氨酸硝化是探討ONOO-對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸殘基硝化作用的基礎(chǔ)。 采用量子化學(xué)計(jì)算中的密度泛函方法,從協(xié)同反應(yīng)與自由基反應(yīng)兩條途徑,對(duì)ONOO-與酪氨酸的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究。ONOO-可以在堿性條件下穩(wěn)定存在,但在生理pH條件下,它會(huì)部分質(zhì)子化為過(guò)氧亞硝酸(

4、peroxynitrous acid,ONOOH,pKa=6.8),ONOO-與ONOOH可共存于溶液體系中。在B3LYP/6-311 G(d,p)計(jì)算水平上對(duì)該反應(yīng)體系中的反應(yīng)物、中間體、過(guò)渡態(tài)和產(chǎn)物進(jìn)行幾何構(gòu)型優(yōu)化,計(jì)算振動(dòng)頻率和能量。計(jì)算結(jié)果表明,ONOOH不易與酪氨酸直接反應(yīng)生成3-硝基酪氨酸(3-NT),其所需能量高于ONOOH分解所需能量；ONOOH分解產(chǎn)生自由基·OH和NO2·后,可再與酪氨酸分步作用,主反應(yīng)路徑為·OH先

5、進(jìn)攻酪氨酸酚羥基H原子,生成中間體酪氨酸自由基,NO2·再與酪氨酸自由基經(jīng)無(wú)勢(shì)壘結(jié)合生成穩(wěn)定的中間體,隨后異構(gòu)化為產(chǎn)物3-NT。在理論研究的基礎(chǔ)上,采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜(HPLC-ESI-ITMS)方法對(duì)ONOO-與酪氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定；通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和核磁共振譜(1HNMR)等分析方法對(duì)收集到的主產(chǎn)物進(jìn)行表征；采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)考察反應(yīng)物濃度和pH等因素對(duì)酪氨酸硝化的影響

6、。 結(jié)果顯示,ONOO-與酪氨酸反應(yīng)可得到兩種產(chǎn)物,其中主產(chǎn)物為3-NT,次產(chǎn)物為羥基酪氨酸,這與理論研究結(jié)果一致。 其次,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)環(huán)境,將ONOO-以恒定速率持續(xù)注入到蛋白質(zhì)溶液中,并保持反應(yīng)體系維持在生理pH條件。采用UV-Vis、HPLC-ESI-ITMS和衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)等分析方法對(duì)ONOO-誘導(dǎo)胰島素酪氨酸殘基的硝化過(guò)程、硝化位點(diǎn)以及胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究。結(jié)

7、果表明,生理pH條件下,ONOO-可誘導(dǎo)胰島素酪氨酸硝化生成3-NT,隨著胰島素暴露于ONOO-中時(shí)間的延長(zhǎng),硝化產(chǎn)物的含量也不斷增加。胰島素分子的4個(gè)酪氨酸殘基中,最多有3個(gè)可被ONOO-硝化,胰島素硝化的混合產(chǎn)物中包含單、雙和三硝化的胰島素,但以單硝化胰島素為主產(chǎn)物。對(duì)胰島素A、B鏈進(jìn)行拆分和酶解,通過(guò)肽譜分析和多肽序列測(cè)定方法確定胰島素被硝化的3個(gè)酪氨酸殘基分別是Tyr-A19、Try-B16與Tyr-B26,其中Yyr-A19是

8、優(yōu)先硝化位點(diǎn),其次是Tyr-B26,最后為T(mén)yr-B16,對(duì)于Tyr-A14卻未觀察到其硝化產(chǎn)物存在。酪氨酸殘基硝化后,胰島素分子的部分折疊結(jié)構(gòu)被打開(kāi),蛋白質(zhì)分子原有的α-螺旋主體結(jié)構(gòu)向隨意卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量由原來(lái)的41.7％降至19.1％,隨意卷曲結(jié)構(gòu)含量由原來(lái)的13.7％增至35.3％。最后,采用UV-Vis和HPLC-ESI-ITMS/MS等分析手段,研究ONOO-誘導(dǎo)p16蛋白的硝化過(guò)程及硝化位點(diǎn)。結(jié)果表明,生理

9、條件下ONOO-可誘導(dǎo)p16蛋白酪氨酸殘基硝化生成3-NT,隨著p16蛋白暴露于ONOO-中時(shí)間的延長(zhǎng),p16蛋白硝化產(chǎn)物也不斷增加。P16蛋白的兩個(gè)酪氨酸殘基均可被ONOO-硝化,反應(yīng)混合物中包含單、雙硝化產(chǎn)物,其中單硝化p16蛋白為主產(chǎn)物。通過(guò)肽譜分析和多肽序列測(cè)定方法,確定Tyr44為優(yōu)先硝化位點(diǎn),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),p16蛋白分子中的另一個(gè)酪氨酸殘基Tyr-129也可被ONOO-硝化。 本論文通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)方法對(duì)ONOO