三種紫色土硝化作用及其硝化微生物的研究.pdf

1、硝化作用是土壤中重要的生物化學過程，包括氨氧化過程和亞硝化過程，其中氨氧化過程是限速步驟。因此，對硝化作用的研究主要集中在氨氧化過程。氨氧化過程是微生物主導的生物過程，最早研究指出氨氧化過程由氨氧化細菌完成，氨氧化古菌的發(fā)現打破了僅由氨氧化細菌完成硝化作用的傳統(tǒng)的觀念，氨氧化古菌的發(fā)現對于完善全球氮循環(huán)有重要的作用。研究不同生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌和氨氧化細菌，至今也還不能明確其在生態(tài)系統(tǒng)中究竟是功能冗余還是競爭導致生態(tài)位分異，也不能明確影

2、響氨氧化細菌和氨氧化古菌在氨氧化過程中相對貢獻率的環(huán)境因子。不同生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化細菌和氨氧化古菌豐度、群落結構和相對貢獻率的研究，對于氨氧化過程有重要意義。其中影響氨氧化作用的環(huán)境因子有多種，如：土壤類型、溫度、水分、氧氣含量和pH、銨態(tài)氮含量等。其中pH和銨態(tài)氮的含量是兩個最關鍵的因子。
　　紫色土是土壤學科中具有特殊地位的土壤之一，主要分布在中國的亞熱帶地區(qū)，以四川盆地為主，在我國農業(yè)生產中占有十分重要的地位。按照 pH和碳酸

3、鹽含量分為酸性、中性和石灰性紫色土。土壤 pH是影響土壤硝化作用的因素之一，不僅會對土壤硝化作用的進程產生影響，而且還會對硝化微生物的數量和群落結構產生影響。
　　本實驗選取采自重慶永川的酸性紫色土(pH=5.3)和中性紫色土(pH=7.2)以及四川鹽亭的石灰性紫色土(pH=8.5)，采用穩(wěn)定性同位素標記技術進行培養(yǎng)實驗。每種土樣共設有三種處理，包括13CO2標記處理、12CO2對照處理和C2H2+13CO2對照處理。土壤樣品在2

4、8℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56天，每周加入100mg/kgN以及相應體積的氣體。培養(yǎng)結束后，對培養(yǎng)0天和培養(yǎng)56天的樣品進行分析測定，測定pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮；實時熒光定量PCR法測定AOA和AOB amoA功能基因的豐度；克隆文庫方法測定AOA和AOB的群落結構；Miseq測序方法測定總的微生物。結果如下：
　　經過56天的培養(yǎng)，三種紫色土C2H2+13CO2處理硝態(tài)氮含量與培養(yǎng)初期相比均沒有變化，說明三種紫色土氨氧化作用都是化能自養(yǎng)

5、微生物完成；中性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為536.2、472.9mg/kg，與培養(yǎng)初期12.7mg/kg相比，明顯升高，發(fā)生了強烈的硝化作用，酸性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為5.2和4.5mg/kg，與培養(yǎng)初期6.1mg/kg相比，沒有明顯變化；石灰性紫色土12CO2和13CO2處理硝態(tài)氮含量分別為5.3和4.0mg/kg，與培養(yǎng)初期0.6mg/kg相比，有略微的增加，與中性紫色土相比，變化幅度

6、較小，硝化作用幾乎沒有進行。
　　三種紫色土經過56天的培養(yǎng)，各處理氨氧化古菌的數量均有不同程度的減小，中性紫色土各處理氨氧化細菌和氨氧化古菌的拷貝數均遠大于酸性紫色土和石灰性紫色土各處理，說明氨氧化微生物適宜在中性環(huán)境下生長。
　　從NO3--N和NH4+-N含量的變化只能知道中性紫色土有硝化作用發(fā)生，從氨氧化細菌和氨氧化古菌的豐度變化可以說明部分氨氧化微生物在起作用，仍需要進一步檢驗是哪種氨氧化微生物發(fā)揮作用。對中性紫色

7、土13CO2標記處理和12CO2對照處理總DNA進行Cscl超高速密度梯度離心，將離心液體分為15層，進行純化，通過普通PCR擴增，結合凝膠電泳，得出初步結論，再對每層進行實時熒光定量PCR，發(fā)現中性紫色土AOA和AOB同時被標記，但是標記程度不深，在中性紫色土中AOA和AOB共同驅動氨氧化過程。采用克隆文庫的方法對中性紫色土各處理樣品構建系統(tǒng)發(fā)育樹，培養(yǎng)初期與56天13CO2培養(yǎng)處理AOA發(fā)揮活性的均屬于Group1.1b，AOB均屬

8、于Nitrosospira cluster3。
　　采用Miseq測序對三種紫色土微生物群落結構進行分析，用shannon值表示測序序列物種的多樣性，中性紫色土shannon值>石灰性紫色土shannon值>酸性紫色土shannon，說明中性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性>石灰性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性>酸性紫色土各處理土壤樣品菌群多樣性。稀釋曲線說明測序數據量是否合理，在0.97相似性水平下，三種紫色土各處理土壤樣品稀釋曲

9、線均趨于平坦，說明測序數據量合格。各處理土壤樣品中都檢測到了Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Actinobacteria(放線菌)、Bacteroidetes(擬桿菌)和Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)，在中性紫色土中檢測到Nitrospirae（硝化螺旋菌門），其中變形菌門在三種紫色土中都大約占有20％

10、的比例。三種紫色土在加入尿素經過56天培養(yǎng)后微生物種類的變化以及比例變化情況不同，酸性紫色土和石灰性紫色土在加入尿素經過56天培養(yǎng)后13C標記處理和乙炔抑制處理變化幅度相同，而中性紫色土13C標記處理和乙炔抑制處理變化幅度不同，13C標記處理變化幅度大于乙炔抑制處理。三種紫色土各處理中氨氧化微生物均屬于Nitrospira(硝化螺菌屬)和Nitrosospira(亞硝化螺菌屬)。通過對中性紫色土13CO2標記處理和12CO2對照處理總D

11、NA分層樣品進行Miseq測序，挑選出其中的硝化微生物序列，發(fā)現AOB和NOB占總測序數的最大比例均出現在重層，對氨氧化微生物的標記程度進行驗證，和定量PCR的結果相同。
　　本研究闡述了三種 pH紫色土硝化作用和氨氧化微生物的差異，探明中性紫色土氨氧化作用的主要推動者。由實驗結果得出以下結論：(1)三種pH紫色土氨氧化微生物的豐度不同，氨氧化微生物適宜在中性環(huán)境下生長。(2)中性紫色土中氨氧化過程由氨氧化細菌和氨氧化古菌共同推動