新型轉(zhuǎn)錄因子人HMBOX1的原核表達(dá)、單克隆抗體的制備及其功能的初步研究.pdf

1、研究目的：
　　 本課題涉及一種新的功能性基因-HMBOX1的研究。HMBOX1屬于Homeobox家族成員，其蛋白N端帶有homeobox結(jié)構(gòu)域，C端帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。到目前為止，HMBOX1已發(fā)現(xiàn)兩種異構(gòu)體，HMBOX1和HMBOX1b(缺失Homeobox結(jié)構(gòu)域)。HMBOX1基因在不同種屬中具有高度保守性，在人類可表達(dá)于18種組織中，其中在胰腺、腦、肝臟、腎臟等組織中高表達(dá)，既可表達(dá)在細(xì)胞漿，也可表達(dá)于細(xì)胞核。HMB

2、OX1是一種潛在的轉(zhuǎn)錄抑制因子，本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)HMBOX1基因?qū)ψ匀粴?xì)胞具有明顯的調(diào)控作用。對HMBOX1具體功能的研究，不僅可以揭示這個新基因的功能，而且可以為進(jìn)一步了解NK細(xì)胞發(fā)育和功能調(diào)節(jié)過程奠定基礎(chǔ)。
　　 新型轉(zhuǎn)錄因子的研究，特別是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和相互作用的研究離不開高特異性的抗體。本研究擬通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HMBOX1重組蛋白并制備其單克隆抗體，然后利用高特異性抗體研究HMBOX1的特征和功能。
　

3、　 1.首先構(gòu)建HMBOX1原核表達(dá)載體，然后通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組融合蛋白。
　　 2.原核蛋白常以包涵體形式存在，所以對重組蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性條件優(yōu)化。
　　 3.以具有天然構(gòu)象的重組蛋白為抗原，通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。
　　 4.確定單克隆抗體的特征并驗(yàn)證單抗的特異性。
　　 5.鑒定單克隆抗體的應(yīng)用范圍。
　　 6.應(yīng)用制備的單抗研究HMBOX1在人體組織中的表達(dá)并初步研究其功

4、能。
　　 研究方法：
　　 1.PCR及RT-PCR構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET22b-HMBOX1-6His。
　　 2.原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 1mM IPTG，37℃4h誘導(dǎo)E.coli Rosetta(DE3)菌株中HMBOX1重組蛋白的表達(dá)。
　　 3.Ni2+親和層析純化和復(fù)性重組HMBOX1蛋白
　　 利用重組蛋白6His標(biāo)簽蛋白，Ni2+親和層析純化蛋白，并通過梯度

5、稀釋的尿素復(fù)性結(jié)合在固相凝膠上包涵體蛋白。
　　 4.制備酸處理裸菌
　　 以鼠傷寒桿菌為基礎(chǔ)經(jīng)稀醋酸處理得到裸菌，作為免疫佐劑。
　　 5.免疫接種動物和雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。
　　 6.注射腹水大量制備單克隆抗體。
　　 7.ELISA和競爭性ELISA鑒定抗體的效價和親和力。
　　 8.SDS-PAG鑒定重組蛋白的表達(dá)。
　　 9.免疫標(biāo)記技術(shù)檢測組織和細(xì)胞中HMBOX1

6、的表達(dá)。
　　 通過Western blot免疫印跡技術(shù)、免疫組化技術(shù)(細(xì)胞爬片，組織芯片)檢測細(xì)胞和組織中HMBOX1的表達(dá)情況；通過免疫熒光技術(shù)結(jié)合顯微鏡檢測HMBOX1的細(xì)胞定位；免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測HMBOX1的胞內(nèi)表達(dá)。
　　 10.免疫共沉淀技術(shù)檢測單克隆抗體的應(yīng)用并檢測肝細(xì)胞系中HMBOX1的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.重組HMBOX1蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性
　　 1.

7、1原核重組表達(dá)載體pET22b-HMBOX1-6His的構(gòu)建
　　 首先，通過RT-PCR制備人自然殺傷細(xì)胞系NK-92細(xì)胞cDNA，利用HMBOX1特異性引物和高保真Ex Taq酶擴(kuò)增得到人HMBOX1基因的蛋白編碼序列，通過測序驗(yàn)證基因序列。然后以此為模板，重新設(shè)計(jì)引物得到改造的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與載體pET22b連接，構(gòu)建得到表達(dá)產(chǎn)物C端帶有信號肽引導(dǎo)序列和6×His標(biāo)簽蛋白的pET

8、22b-HMBOX1表達(dá)載體。
　　 1.2重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性
　　 將構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)菌株，此菌株能夠表達(dá)含有大量稀有堿基的人體蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，通過1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以不可溶的包涵體形式存在。為獲得具備天然構(gòu)象的HMBOX1，重組蛋白經(jīng)鎳親和層析技術(shù)同步純化和復(fù)性，復(fù)性采用濃度梯度降低的尿素灌流液流經(jīng)親和柱，使吸附在固相載體上的蛋白重新折疊，最后收集重

9、新折疊的重組HMBOX1蛋白。然后質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白測序，驗(yàn)證了復(fù)性HMBOX1蛋白的序列正確性。另外，非變性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳證實(shí)，重組蛋白具備了天然構(gòu)象并可形成二聚體，說明重組蛋白可能具有HMBOX1的天然構(gòu)象。
　　 2.HMBOX1單克隆抗體的制備
　　 2.1單克隆抗體的制備
　　 以酸處理的鼠傷寒桿菌裸菌作為佐劑與復(fù)性重組HMBOX1蛋白一起免疫接種小鼠。蛋白質(zhì)抗原可以吸附在酸處理裸菌上

10、，表明可增強(qiáng)其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。當(dāng)抗體效價達(dá)到一定程度時，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，獲得兩株HMBOX1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞：2A5F4和4A4F2。
　　 2.2單克隆抗體的特征及應(yīng)用研究
　　 免疫球蛋白類型鑒定證明：2A5F4株單抗為IgG2b/κ類型，4A4F2株單抗為IgM/κ類型。ELISA和競爭性ELISA試驗(yàn)表明：純化的2A5F4株單抗的效價和親和力分別為1.024×10-5和3.67×108M-1；純化的4A4

11、F2株單抗的效價和親和力分別為5×10-5和3.35×108M-1。這兩株抗體具備較高的靈敏度并能特異性地和原核蛋白以及天然構(gòu)象真核蛋白結(jié)合。經(jīng)免疫印跡和免疫組化分析驗(yàn)證，4A4F2株抗體能檢測到HMBOX1在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)變化，即在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMBOX1的細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)增加，在轉(zhuǎn)染siRNA/HMBOX1的細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)降低。而2A5F4株單抗僅能應(yīng)用于免疫組化技術(shù)的檢測。因此，這兩株單抗可與

12、具有天然構(gòu)象的真核蛋白發(fā)生特異性結(jié)合并能應(yīng)用于免疫印跡和免疫組化的檢測分析。另外，制備的單克隆抗體可應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)檢測和免疫共沉淀等多種免疫分析技術(shù)，為HMBOX1的體外作用機(jī)制研究提供了可靠的技術(shù)支持。尤其是2A5F4和4A4F2分別作為共沉淀抗體和免疫印跡抗體可以對肝臟細(xì)胞中的HMBOX1進(jìn)行免疫共沉淀分析，為進(jìn)一步HMBOX1的靶基因研究和蛋白質(zhì)相互作用研究提供了技術(shù)保障。
　　 3.人體組織中HMBOX1表達(dá)譜研究

13、及腫瘤表達(dá)差異性研究
　　 3.1細(xì)胞內(nèi)HMBOX1蛋白的定位和組織分布
　　 利用制備的高特異性單克隆抗體，通過免疫熒光技術(shù)研究HEK-293T細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HMBOX1蛋白同時表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，這也表明HMBOX1發(fā)揮生理作用的可能機(jī)制為從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。
　　 以人體組織石蠟切片和組織芯片為研究對象，發(fā)現(xiàn)HMBOX1在多種人體組織中表達(dá)，特別在腎臟，大腦，甲狀腺，胃，腸，肝，胰腺，肺

14、，心臟肌肉，睪丸和前列腺等組織表達(dá)量較高。
　　 3.2 HMBOX1在人體正常組織和腫瘤組織中表達(dá)譜的差異
　　 HMBOX1可在多類型腫瘤組織中表達(dá)。與癌旁組織相比，在一些腫瘤中存在差異表達(dá)。肝癌組織中的HMBOX1蛋白水平比癌旁組織顯著性的減少；腎臟組織中的HMBOX1主要表達(dá)在腎小管，而在腎小球中表達(dá)很低，特別在腎小管來源的腎透明細(xì)胞癌腫高度表達(dá)；胰腺組織和腫瘤中都可見HMBOX1的高度表達(dá)，但未發(fā)現(xiàn)明顯差異。H

15、MBOX1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)，這為進(jìn)一步研究HMBOX1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供了細(xì)胞研究模型。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了重組人HMBOX1原核表達(dá)載體pET22b-HMBOX1-6His。
　　 2.在E.coli Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)了重組HMBOX1蛋白，并利用His親和層析的方法對HMBOX1包涵體蛋白成功的進(jìn)行了復(fù)性。復(fù)性蛋白具有HMBOX1的天然構(gòu)象。
　　

16、3.制備了兩株特異性HMBOX1單克隆抗體：2A5F4和4A4F2。
　　 4.兩株單抗可特異性識別真核構(gòu)象HMBOX1，并應(yīng)用于western blot和免疫組化檢測。
　　 5.HMBOX1既可以表達(dá)在細(xì)胞漿也可以表達(dá)于細(xì)胞核。
　　 6.HMBOX1在多種組織中高表達(dá)，如肝臟、腎臟、胰腺和腦組織。
　　 7.HMBOX1在多種腫瘤組織中存在差異表達(dá)，特別是正常肝臟組織中的表達(dá)顯著高于肝癌組織中的表達(dá)

17、。
　　 8.肝細(xì)胞系HMBOX1的表達(dá)研究為闡明肝臟和肝癌中HMBOX1的功能提供了技術(shù)支持。
　　 研究意義
　　 本課題建立了一種HMBOX1原核蛋白表達(dá)、純化和復(fù)性的有效方案，并在此基礎(chǔ)上制備獲得兩株高特異性單克隆抗體。這兩株單克隆抗體可用于多種免疫檢測分析，為進(jìn)一步研究HMBOX1的功能奠定了基礎(chǔ)。另外，HMBOX1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可能參與了腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制，并可能對糖物質(zhì)代謝具有調(diào)控作用。所以，H