心理應激對大鼠小腸鐵吸收的影響及機制研究.pdf

1、背景： 鐵是幾乎所有活體中的一種必需元素。在細胞呼吸鏈電子傳遞、能量代謝、血紅素代謝、氧的運輸、細胞信息傳遞、DNA合成、免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。大量研究表明,鐵缺乏或鐵過量都會對機體產生不利影響,因此維持機體鐵穩(wěn)態(tài)尤為重要,機體缺乏有效的鐵“排泄機制”,機體鐵穩(wěn)態(tài)的維持主要通過腸道鐵吸收的精細調控實現。目前對鐵吸收的研究機制發(fā)現,小腸中有兩種主要鐵轉運體即二價金屬離子轉運體DMT1和ferroportin1(FPN1)在鐵

2、吸收調節(jié)方面發(fā)揮重要作用。DMT1是一種跨膜蛋白,轉運二價鐵離子跨越小腸上皮細胞的頂端進入腸細胞,FPN1是位于基底膜上的鐵轉出蛋白,將鐵離子轉運進入血液循環(huán)。為保證機體的鐵平衡,機體需要在鐵吸收、利用和儲存之間進行協調,在最近幾年的研究中發(fā)現,Hepcidin(由HAMP基因編碼)是鐵穩(wěn)態(tài)的一個主要調節(jié)因子。Hepcidin是肝細胞分泌的一種循環(huán)肽,并通過結合細胞表面的ferroportin而導致ferroportin的內化和降解從而

3、導致鐵釋放減少。 心理應激(psychological stress)是機體通過認識、評價而察覺到應激源的威脅時引起的心理、生理技能改變的過程,是個體對面臨的威脅或挑戰(zhàn)作出適應和應付的過程。隨著社會的發(fā)展及各方面競爭壓力的增加,來源于社會的精神心理因素的應激對人類健康的影響越來越強烈,并成為重要的應激源。許多研究證實,在心血管疾病、內分泌疾病、神經精神疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生中心理應激起了重要作用。軍人作為一個特殊群體,經常要

4、面對突發(fā)性事件,如戰(zhàn)爭爆發(fā),反恐怖襲擊執(zhí)行特種任務等等,這些特殊情況和特種作業(yè)條件都容易誘發(fā)軍人心理應激反應。前期研究發(fā)現,心理應激可引起機體鐵代謝紊亂,造成血清鐵明顯下降、肝細胞鐵明顯增加。一方面,鐵缺乏而引起的最大氧攝入和肌細胞的氧化代謝能力降低,而另一方面,鐵過量又會導致大量自由基的產生,故心理應激引起機體鐵穩(wěn)態(tài)破壞可影響指戰(zhàn)員的健康,進而影響部隊作戰(zhàn)能力。因此,闡明心理應激血清鐵下降和肝臟鐵蓄積的發(fā)生機制,以及預防和治療措施,無

5、疑將對防治軍人應激損傷產生有積極的意義。因此,我們進行了如下研究： 目的： 了解心理應激對小腸鐵吸收的影響及其機制探討,為闡明心理應激與血清鐵下降的關系以及深入探討軍事應激對機體因鐵穩(wěn)態(tài)改變而引起的作戰(zhàn)能力的下降提供實驗基礎,并為防治心理應激導致的低鐵血癥提供新思路。 方法： 一、心理應激模型的制作。 采用Communication Box System制作大鼠心理應激模型。Communicati

6、on Box System由透明丙烯酸板組成,一半小室(A室)底部鋪板絕緣,另一半小室(B室)通電。在B室的實驗大鼠接受30min/d,足底電擊(電壓90V,電流0.80mA);電擊組大鼠跳躍,尖叫,在A室的實驗大鼠通過視覺聽覺產生恐懼的心理反應,即為心理應激大鼠模型。 ELISA法測定血清促腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質酮(CORT)含量,放免試劑盒測定下丘腦內去甲腎上腺素(NE)含量。 二、心理應激對大鼠鐵吸收的影

7、響。 (一)實驗動物分組雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨機分為空白對照組(CG)、心理應激7天組(PSG)和足底電擊組(FSG),每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50％～60％；使用不銹鋼代謝籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食及去離子水,飼料配方為AIN-93G,鐵含量為35mg/kg飼料。自然晝夜節(jié)律變化光照。 (二)大鼠心理應激模型的制作方法同前。心理應激組連續(xù)心理應

8、激7天。 (三)大鼠鼠糧攝入量測定每天更換大鼠鼠糧,使用電子天平精確稱量大鼠鼠糧日攝入量。 (四)大鼠糞便收集為使糞便收集齊全,在大鼠從代謝籠中移至心理應激模型中,大鼠單個塑料籠轉運。為使糞便收集精確,通過卡紅標記糞便(收集兩次紅色之間的糞便,不包括第二次紅色糞便)。 (四)大鼠鐵表觀吸收率的計算大鼠鐵表觀吸收率通過經典的代謝平衡法計算,即計算一定時間內的鐵攝入量及排泄物鐵含量而得,由于尿中鐵含量甚微,可忽略不計

9、。因此鐵表觀吸收率=(攝入鐵含量-糞便鐵含量)×100％/攝入鐵含量。 (五)大鼠小腸Perl's鐵染色各時間段心理應激完成后腹腔注射2％戊巴比妥進行麻醉,暴露胸腔,剪開右心耳,然后迅速經心臟冷PBS沖洗,取小腸組織4％多聚甲醛固定后石蠟切片制成5μm切片用于Perl's鐵染色。 三、心理應激對大鼠小腸鐵吸收機制的影響。 (一)實驗動物分組雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨

10、機分為空白對照組(CG,n=30)、心理應激1天組(PSG1,n=10)、心理應激3天組(PSG3,n=10)、心理應激7天組(PSG7,n=10)和足底電擊組(FSG,n=10)。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50％～60％；使用不銹鋼代謝籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食及去離子水,飼料配方為AIN-93G,鐵含量為35mg/kg飼料。自然晝夜節(jié)律變化光照。 (二)心理應激模型制作方法同前。心理應激1天組：心理應激1天；心理應

11、激3天組：連續(xù)心理應激3天；心理應激7天組：連續(xù)心理應激7天。 (三)心理應激對肝臟IL-6含量的影響EUSA法檢測心理應激1天組,3天組,7天組及對應的空白對照組肝臟IL-6含量。 (四)心理應激對小腸Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝臟Hepcidin的影響Wlestern Blot檢測各實驗組及空白對照組小腸粘膜鐵蛋白,二價金屬離子轉運體含鐵反應原件和非鐵反應原件,膜鐵轉運蛋白及肝臟He

12、pcidin蛋白表達情況。 四、心理應激IL-6干預后對小腸鐵吸收機制影響的研究。 (一)實驗動物分組于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心購得SD雄性大鼠40只,分為正常對照組(CG,n=10)、心理應激組(PG,n=10)和心理應激干預組(A-PG,n=10)及軀體電擊組(n=10)。心理應激干預組于應激前腹腔注射100μl的PBS(含2μg的IL-6 Antibody)/只大鼠,心理應激組于應激前注射PBS 100μl/只大鼠

13、。 (二)心理應激模型制作方法同前。 (三)心理應激IL-6干預后大鼠十二指腸Perl's染色方法同前。 (四)心理應激對大鼠小腸Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝臟Hepcidin的影響Western Blot檢測各實驗組及空白對照組小腸粘膜鐵蛋白,二價金屬離子轉運體含鐵反應原件和非鐵反應原件,膜鐵轉運蛋白及肝臟Hepcidin蛋白表達情況五、數據統計與處理實驗數據采用SPSS13.

14、0統計軟件包采用兩樣本t檢驗及單因素方差分析進行數據分析,實驗數據以平均數±標準差(X-±S)表示,顯著性水平為P<0.05,非常顯著性水平為P<0.01。 結論： 本研究通過Communication Box成功制造了心理應激模型,觀察了心理應激情況下的鐵吸收變化及通過Western Blotting觀察了心理應激對與鐵吸收密切相關的主要因子的表達變化。主要結論如下： 1、隨著心理應激的時間延長,大鼠對鐵的吸收

15、減少,同時小腸粘膜鐵染色發(fā)現小腸粘膜細胞有鐵潴留。 2、隨著心理應激時間的延長,肝臟IL-6含量明顯增多,且肝臟Hepcidin表達增加。進而小腸FP1表達逐漸減少,提示心理應激可能是通過IL-6的升高誘導肝臟Hepcidin的表達增加,最終影響小腸運出蛋白FP1的表達減少來抑制小腸鐵吸收。 3、發(fā)現小腸DMT1(+IRE)的表達變化落后于小腸FP1的變化,提示可能是小腸運出蛋白FP1表達減少后,促使腸細胞合成鐵蛋白增加