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文檔簡介
1、目的:應(yīng)激是指機(jī)體在受到內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)以交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮和下丘腦—垂體—腎上腺軸激活,皮質(zhì)激素分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng),是一種全身性的非特異適應(yīng)反應(yīng)。越來越多的證據(jù)顯示應(yīng)激可以增加包括傳染性病原體導(dǎo)致的炎癥性疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病率。免疫系統(tǒng)作為身心關(guān)系的橋梁,其在應(yīng)激時所受到的影響越來越受到人們的重視,應(yīng)激對機(jī)體免疫功能的影響已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。
應(yīng)激在功能性胃腸道疾病發(fā)病及疾病進(jìn)
2、展中的作用機(jī)制是目前基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究中的重要課題之一。應(yīng)激與多種功能性胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胃腸道不僅是機(jī)體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所,也是應(yīng)激時的重要靶器官,同時還是體內(nèi)重要的免疫組織器官,發(fā)揮著重要的免疫防護(hù)作用。由完整的上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞刷狀緣的脂質(zhì)雙分子層以及細(xì)胞側(cè)緣由黏著連接和緊密連接構(gòu)成的細(xì)胞連接組成的腸道黏膜屏障具有機(jī)械屏障作用,可以有效阻擋病體侵入體內(nèi),是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)抵御外來異物入侵的第一道防線之一,腸相關(guān)淋巴
3、組織是發(fā)生局部特異性免疫應(yīng)答的主要場所,腸黏膜固有層漿細(xì)胞產(chǎn)生的分泌型IgA使得腸道免疫成為全身免疫的一部分,存在于胃腸道的多種免疫細(xì)胞一方面通過其細(xì)胞膜上分布的多種受體接受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié),另一方面可以通過分泌多種細(xì)胞因子作用于其它免疫細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。
魯比前列酮(Lubiprostone),是一種局部作用的Ⅱ型氯離子通道激活劑,最初用于治療成人慢性特發(fā)性便秘,后來又被批準(zhǔn)用于治療成人腸易激綜合征。
心理應(yīng)
4、激導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)改變在不同的時間點(diǎn),其作用模式有何不同?在慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致胃腸道疾病發(fā)生的過程中,腸道黏膜機(jī)械屏障是否受到損傷?腸道免疫屏障是否會隨之受到影響?魯比前列酮可否用于應(yīng)對心理應(yīng)激導(dǎo)致的腸道屏障異常?
為深入研究心理應(yīng)激對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響,本研究以SD大鼠為研究對象,建立心理應(yīng)激動物模型,在不同時間點(diǎn)分別檢測心理應(yīng)激對機(jī)體全身免疫和腸道局部免疫所造成的影響,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討心理應(yīng)激導(dǎo)致腸道局部黏膜改變的靶分子
5、,研究魯比前列酮對其發(fā)揮作用的可能性和可能的作用機(jī)制。
方法:
1.影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型的建立及心理應(yīng)激對免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響我們首先建立了可以影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型,應(yīng)用此動物模型動態(tài)觀察在心理應(yīng)激發(fā)生的不同階段機(jī)體免疫系統(tǒng)可能發(fā)生的改變,明確心理應(yīng)激在不同時間點(diǎn)對免疫系統(tǒng)的影響模式。
以SD大鼠為研究對象,建立心理應(yīng)激作用動物模型,觀察心理應(yīng)激對大鼠一般狀況的影響,通過對大鼠排便情況的觀
6、察和對內(nèi)臟敏感性的檢測明確WAS是可以影響大鼠腸道功能的心理應(yīng)激動物模型。
在不同的時間點(diǎn)收集大鼠血清,應(yīng)用ELISA法檢測血清中循環(huán)細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平,明確急性和慢性心理應(yīng)激對機(jī)體全身免疫可能造成的影響。
分離大鼠結(jié)腸,應(yīng)用高通量qPCR來初步篩選慢性心理應(yīng)激可能會影響的免疫分子、黏附分子、神經(jīng)遞質(zhì)等,為下一步研究指明方向。
2.心理應(yīng)激對大鼠腸道局部
7、免疫功能的動態(tài)影響在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,繼續(xù)應(yīng)用WAS動物模型,明確心理應(yīng)激在不同的時間點(diǎn)對腸道局部免疫的影響模式。
應(yīng)用實(shí)時定量PCR和Western Blot方法檢測不同的時間點(diǎn)局部結(jié)腸組織中IL-1β、IL-2、IFN-γ、 IL-6、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
應(yīng)用ELISA檢測腸液中SIgA的水平。
3.慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機(jī)制在明確心
8、理應(yīng)激對腸道免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響后,進(jìn)一步研究慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機(jī)制。
篩選最佳的藥物作用劑量,使用該劑量在假應(yīng)激或慢性心理應(yīng)激之前給予大鼠口服魯比前列酮。連續(xù)10天WAS結(jié)束后,分離大鼠腸道上皮細(xì)胞和腸液。
應(yīng)用實(shí)時定量PCR檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連接分子轉(zhuǎn)錄水平的影響。
應(yīng)用Western Blot檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連
9、接蛋白表達(dá)水平的影響。
應(yīng)用免疫熒光法檢測魯比前列酮對慢性心理應(yīng)激大鼠腸上皮緊密連接蛋白形態(tài)學(xué)的影響。
應(yīng)用ELISA檢測魯比前列酮作用后慢性心理應(yīng)激大鼠腸液中SIgA的水平變化。
結(jié)果:
1.影響腸道功能的心理應(yīng)激動物模型的建立及心理應(yīng)激對免疫系統(tǒng)的動態(tài)影響慢性心理應(yīng)激可以顯著抑制大鼠的體重增長,應(yīng)激原去除后,其抑制作用隨著時間的推移可以消失。心理應(yīng)激可以影響自主神經(jīng)系統(tǒng)對遠(yuǎn)端結(jié)腸動力的調(diào)控,刺
10、激大鼠排便,能夠顯著提高實(shí)驗(yàn)動物的內(nèi)臟痛覺敏感。
與對照組相比,急、慢性心理應(yīng)激可以在不同時間段引起不同細(xì)胞因子在血清中的表達(dá)水平的改變,其中,1次避水應(yīng)激后1小時時大鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ顯著上升(P<0.05),1次避水應(yīng)激后24小時時,IL-1β、IL-6顯著上升(P<0.05),而慢性應(yīng)激對IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達(dá)水平的影響無顯著差異(P>0.05)。
高通
11、量篩選顯示慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致結(jié)腸中多種分子轉(zhuǎn)錄水平改變,上調(diào)的主要有Adenosine A1 receptor、BDNF、CCL12、CD200、Claudin2、CDK2、HDAC2、HDAC4、IL-6、Integrin-alpha M、P2RX3等,出現(xiàn)下調(diào)的有Aurora kinase A、BAZ1b、Claudin1、Claudin6、CB2、CSF1、 DMNT1、PRMT1。
2.心理應(yīng)激對大鼠腸道局部免疫功能
12、的動態(tài)影響實(shí)時定量PCR檢測顯示急性心理應(yīng)激(1次避水應(yīng)激后1小時、24小時)及慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致不同時間點(diǎn)不同細(xì)胞因子的mRNA水平發(fā)生改變。其中,急性、慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6表達(dá)水平上升(P<0.05),1次避水應(yīng)激后1小時、24小時時大鼠結(jié)腸TNF-α表達(dá)水平上升(P<0.05),1次避水應(yīng)激后24小時時大鼠結(jié)腸IL-2、IL-10表達(dá)水平上升(P<0.05),慢性心理應(yīng)激對IL-2、IL-10、TNF
13、-α和IFN-γ表達(dá)水平無顯著影響(P>0.05)。
Western Blot檢測顯示急性心理應(yīng)激及慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6表達(dá)水平上升(P<0.05),1次避水應(yīng)激后24小時及慢性心理應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠結(jié)腸IL-2表達(dá)水平上升(P<0.05),急性心理應(yīng)激(1次避水應(yīng)激后1小時、24小時)后,大鼠結(jié)腸TNF-α表達(dá)水平上升(P<0.05),急、慢性心理應(yīng)激對IL-10、IFN-γ的均無顯著影響(P>0.
14、05)。該結(jié)果與實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果基本平行。
ELISA檢測顯示急性心理應(yīng)激(1次避水應(yīng)激后1小時、24小時)后,大鼠結(jié)腸腸液中SIgA水平上升(P<0.05),慢性心理應(yīng)激對腸液中SIgA的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3.慢性心理應(yīng)激及魯比前列酮對大鼠腸上皮緊密連接蛋白的改變及其作用機(jī)制首先通過對內(nèi)臟敏感性的檢測實(shí)驗(yàn)確定魯比前列酮的最佳使用劑量為20μg/kg/day,每天兩次給藥。隨后應(yīng)用實(shí)時定量PC
15、R和Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn)慢性心理應(yīng)激可以在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平顯著下調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá),鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)對照組緊密連接蛋白在上皮的頂端膜側(cè)表達(dá),在腸上皮黏膜層分布均勻,分布廣泛,熒光信號明顯,表達(dá)量豐富,而慢性應(yīng)激組的熒光信號減弱,呈不連續(xù)分布,魯比前列酮可以部分逆轉(zhuǎn)慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致的緊密連接蛋白Claudin-1和Occludin表達(dá)下降,但對ZO-1蛋白無顯著
16、作用。慢性心理應(yīng)激可以導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞Claudin-2的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),這種上調(diào)和ZO-1的下調(diào)一樣無法被魯比前列酮所逆轉(zhuǎn)。
結(jié)論:
1.慢性心理應(yīng)激可以增加大鼠腸道痛覺敏感性。
2.急性心理應(yīng)激上調(diào)血清中IL-1β、 IL-6的表達(dá),急性心理應(yīng)激和慢性心理應(yīng)激均可以顯著上調(diào)腸道局部IL-1β、IL-6的表達(dá)。
3.慢性心理應(yīng)激可以顯著下調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Oc
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