SAK-HV蛋白對小腸膽固醇吸收的影響及機(jī)制研究.pdf

1、膽固醇是哺乳動物細(xì)胞膜的重要組成部分，對于維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵的作用，其在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞的分化和胚胎的發(fā)育等生理過程中也發(fā)揮著重要作用，但細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平升高會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，血漿膽固醇水平升高會誘發(fā)多種疾病，如動脈粥樣硬化和冠心病等。研究表明，通過飲食攝入過多的膽固醇是導(dǎo)致高膽固醇血癥的主要原因之一，因此，有關(guān)膽固醇吸收的研究是目前脂類代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　SAK-HV蛋白是本實(shí)驗(yàn)室前期

2、構(gòu)建的一種多功能融合蛋白，分子量17KD，其分子結(jié)構(gòu)包含突變的SAK(Staphylokinase，葡激酶)分子、RGD序列以及水蛭素12肽序列，其中SAK分子主要發(fā)揮溶解纖維蛋白的作用，RGD序列可以抑制血小板聚集，水蛭素12肽序列則可以抑制凝血酶引起的炎癥反應(yīng)。構(gòu)建SAK-HV蛋白的最初目的是期望針對溶栓、抗凝和抗炎三方面實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)抗動脈粥樣硬化的作用。在藥效學(xué)研究中我們發(fā)現(xiàn)SAK-HV蛋白可以抑制高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈粥樣

3、硬化斑塊的發(fā)展和血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，此外我們驚奇地發(fā)現(xiàn)其還可以降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血漿膽固醇水平，但是其降膽固醇的機(jī)制尚不清楚。
　　哺乳動物體內(nèi)膽固醇的代謝包括膽固醇的吸收、合成以及排泄等。小腸是機(jī)體膽固醇吸收的主要場所，表達(dá)于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的NPC1L1蛋白是參與小腸膽固醇吸收的重要蛋白，NPC1L1蛋白通過其NH2端的一個富含半胱氨酸的氨基端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)結(jié)合膽固醇

4、，隨后通過囊泡內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從而介導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞對膽固醇的吸收。研究表明NPC1L1基因敲除小鼠的小腸膽固醇吸收水平降低了70％，而NPC1L1的抑制劑Ezetimibe可以降低高脂喂養(yǎng)的斑馬魚的血漿膽固醇水平。另外表達(dá)于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的ABCG5/ABCG8蛋白則可以將小腸吸收的游離膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)至腸腔隨糞便排出，研究表明小鼠ABCG8基因的缺失明顯升高了小腸對膽固醇和谷固醇的吸收，而小鼠ABCG5和ABCG8過表達(dá)則會降低

5、膽固醇和谷固醇的吸收。肝X受體(Liver X receptor，LXR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，其亞型LXRα(Liver X receptor-a)和LXRβ(Liver X receptor-β)在機(jī)體脂質(zhì)代謝中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。文獻(xiàn)報(bào)道Caco-2細(xì)胞和小鼠小腸中LXRα和LXRβ表達(dá)的上調(diào)可以降低NPC1L1的表達(dá)并上調(diào)ABCG5和ABCG8的表達(dá)。肝臟是膽固醇合成的主要場所，羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原

6、酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)是膽固醇合成過程中的限速酶，哺乳動物肝臟中的ABCG5/ABCG8蛋白可以促進(jìn)肝臟膽固醇排泄至膽汁，此外，在人和靈長類動物肝臟中表達(dá)的NPC1L1蛋白參與了膽汁中膽固醇的重吸收。
　　前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SAK-HV蛋白可以顯著降低高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的血漿膽固醇水平，但其是否通過抑制小腸膽固醇的吸收起作用，這需要我們進(jìn)一步的研

7、究證實(shí)。因此本研究通過動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了SAK-HV蛋白對小腸膽固醇吸收的影響及可能的機(jī)制，由于肝臟在膽固醇代謝中的重要作用，我們同時(shí)也關(guān)注了其對參與肝臟膽固醇合成和排泄的相關(guān)基因表達(dá)的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分為如下兩部分:
　　1、動物水平研究SAK-HV蛋白對膽固醇吸收的影響及可能的機(jī)制:
　　前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠給予SAK-HV蛋白處理后血漿膽固醇水平降低，因此本研究以ApoE-/-小

8、鼠為實(shí)驗(yàn)對像，高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂動物模型，同時(shí)以野生型C57小鼠為對照組，給予正常飼料喂養(yǎng)，高脂飼料喂養(yǎng)一周后檢測血脂水平發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水平明顯高于對照組C57小鼠，而高密度脂蛋白(HDL)則無明顯變化，表明高脂模型建立成功。隨后按體重將高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組和二個SAK-HV蛋白給藥組（0.125mg/kg給藥組、0.5mg/kg給藥

9、組），每組12只，給藥組小鼠尾靜脈注射連續(xù)給藥14天，模型組小鼠給予同等體積的生理鹽水，給藥結(jié)束后檢測血脂水平發(fā)現(xiàn)SAK-HV蛋白給藥組小鼠血漿TC和TG水平相較于模型組明顯降低，但給藥組兩組之間并無明顯差異，LDL和HDL則無顯著變化，說明SAK-HV蛋白可以降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血漿膽固醇水平。隨后我們選擇0.5mg/kg給藥組和模型組ApoE-/-小鼠為研究對象，研究SAK-HV降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血漿膽固醇的機(jī)

10、制，qPCR和Westernblot分別檢測小腸和肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠小腸NPC1L1的表達(dá)降低、而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表達(dá)水平升高，LXRα的表達(dá)則有輕度下調(diào)。在肝臟中，ABCG5/ABCG8和LXRα/LXRβ的表達(dá)水平兩組之間未見差異，但給藥組HMGCR的表達(dá)水平較模型組表達(dá)下調(diào)。
　　2、細(xì)胞水平研究SAK-HV蛋白對膽固醇吸收的影響及可能的機(jī)制
　　為了進(jìn)

11、一步驗(yàn)證動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們以Caco-2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，在體外研究SAK-HV蛋白對小腸上皮細(xì)胞膽固醇吸收的影響，分別給予不同濃度的SAK-HV蛋白刺激24h后，以NBD-膽固醇作為熒光探針檢測Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50μg/ml濃度時(shí)Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收水平明顯降低。利用qPCR和Westernblot檢測Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，NPC1L1的表達(dá)在100μg/ml

12、時(shí)顯著下調(diào)，而ABCG5和ABCG8分別在20μg/ml和50μg/ml時(shí)表達(dá)上調(diào)，LXRα mRNA和蛋白的表達(dá)水平在20μg/ml濃度時(shí)表達(dá)上調(diào)，但LXRβ僅在100μg/ml時(shí)表達(dá)上調(diào)。隨后我們以100μg/ml的SAK-HV蛋白刺激Caco-2細(xì)胞不同時(shí)間研究不同刺激時(shí)間對Caco-2細(xì)胞膽固醇吸收和相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示當(dāng)100μg/ml的SAK-HV刺激6h時(shí)Caco-2細(xì)胞膽固醇的吸收水平顯著降低，qPCR和West

13、ernblot的檢測結(jié)果表明NPC1L1在刺激6h時(shí)表達(dá)下調(diào)，ABCG5/ABCG8的蛋白表達(dá)水平在刺激3h時(shí)上調(diào)，LXRα的表達(dá)在刺激12h時(shí)表達(dá)上調(diào)，而LXRβ的表達(dá)水平在刺激3h時(shí)已經(jīng)上調(diào)。
　　由于在動物試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)SAK-HV給藥組的高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠肝臟膽固醇合成限速酶HMGCR的表達(dá)降低，為了研究SAK-HV蛋白在體外對肝細(xì)胞膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，我們以HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，以不同濃度SAK-

14、HV蛋白刺激24h，qPCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示SAK-HV蛋白對HepG2細(xì)胞的NPC1L1、ABCG5/ABCG8、LXRα/β以及HMGCR表達(dá)均無影響。
　　綜上所述我們通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SAK-HV蛋白可以降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血漿膽固醇水平，并發(fā)現(xiàn)小腸NPC1L1蛋白表達(dá)下調(diào)，而ABCG5/ABCG8和LXRβ的表達(dá)上調(diào)。我們推測SAK-HV蛋白可能通過激活小腸LXRβ的表達(dá)，調(diào)節(jié)其下游靶基因

15、NPC1L1和ABCG5/ABCG8的表達(dá)從而抑制小腸膽固醇的吸收，并最終達(dá)到降低血漿膽固醇的效果。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步證實(shí)了SAK-HV蛋白可以抑制Caco-2細(xì)胞膽固醇的吸收，并揭示了與動物實(shí)驗(yàn)相同的機(jī)制。因此我們初步得出結(jié)論:SAK-HV蛋白可以抑制小腸膽固醇的吸收，其作用機(jī)制可能為，SAK-HV蛋白激活轉(zhuǎn)錄因子LXRα/β的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)小腸NPC1L1和ABCG5/8的表達(dá)，最終抑制了小腸膽固醇的吸收。以上的研究結(jié)果為SAK