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文檔簡介
1、隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的改變,心腦血管疾病已經(jīng)成為嚴重危害人們健康的疾病之一。心腦血管疾病的病因目前尚不完全清楚,但血脂異常特別是高膽固醇血癥是導致心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素已經(jīng)得到了大多數(shù)研究的支持,所以維持正常的血脂水平顯得尤為重要而且迫切。 肝臟在調(diào)節(jié)機體膽固醇平衡中發(fā)揮著重要作用。首先,3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶( hepatic3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzy
2、me A,HMG-CoAreductase)是膽固醇合成的限速酶。其次,膽固醇在肝中轉(zhuǎn)化為膽汁酸是其在體內(nèi)代謝的主要去路,而膽固醇7α-羥化酶(Cholesterol7α-Hydroxylase,CYP7A1)是調(diào)節(jié)膽汁酸合成的限速酶,所以這兩個酶在維持機體膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。本研究擬采用不同劑量的橄欖油替代高脂飼料中相應比例的豬油,觀察對大鼠血膽固醇水平、肝臟中HMG-CoA reductase mRNA和CYP7A1mRNA
3、表達量的影響,研究橄欖油是否能通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)這兩個基因的表達而影響血膽固醇水平,以求闡明橄欖油對大鼠血膽固醇水平影響的機制,為指導居民合理膳食,預防營養(yǎng)相關的慢性病提供科學依據(jù)。 材料與方法: 一、動物分組 選擇45只健康雄性Wistar大鼠,體重100g-135g。適應性飼養(yǎng)1w后,按體重隨機分為5組(每組9只):基礎對照組(基礎組),豬油對照組(豬油組),橄欖油低劑量組(橄欖油Ⅰ組),橄欖油中劑量組(橄欖
4、油Ⅱ組),橄欖油高劑量組(橄欖油Ⅲ組)?;A組喂基礎飼料,豬油組喂豬油高脂飼料(83.75%的基礎飼料,15%豬油,0.25%膽鹽,1%膽固醇)。各橄欖油干預組的飼料分別用6%、10%、15%的橄欖油代替豬油高脂飼料中相同比例的豬油,干預8W。 二、樣品采集 實驗結束時,對大鼠進行稱重;禁食12h后,在乙醚麻醉下,由腹主動脈采血,分離血清;同時分離肝臟及雙側(cè)腎周、附睪周圍和腸系膜等處脂肪,分別稱重記錄。 三、指標
5、分析 (1)血脂測定:按試劑盒說明,在ECOM-F6124半自動生化分析儀(德國Eppendorf)上測定血清中總膽固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)。
6、 (2)觀察各組大鼠肝臟病理改變:觀察各組大鼠肝臟的形態(tài)、質(zhì)地及色澤的改變;取小塊肝組織放入10%中性甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察大鼠肝組織病理學改變。 (3)計算肝指數(shù)和臟器周圍脂肪/體重比值 ①肝指數(shù)(%)=肝重(g)/體重(g)×100; ②腎周脂肪重/體重比值(%)=雙側(cè)腎周脂肪重(g)/體重(g)×100; ③睪丸周圍脂肪重/體重比值(%)=雙側(cè)睪丸周圍脂肪重(g)
7、/體重(g)×100; ④腸系膜脂肪重/體重比值(%)=腸系膜脂肪墊重(g)/體重(g)×100; ⑤總脂肪重/體重比值(%)=[雙側(cè)腎臟周圍脂肪重(g)+雙側(cè)附睪周圍脂肪重(g)+腸系膜脂肪墊重(g)]/體重(g)×100; (4)肝臟中HMG-CoA reductase mRNA和CYP7A1 mRNA表達量的測定:將保存于-70℃冰箱中的肝組織取出,按Takara RT-PCR試劑盒說明擴增各組大鼠肝臟中H
8、MG-CoA reductase mRNA和CYP7A1 mRNA。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。擴增反應條件為:94℃2min;94℃30sec,54℃30sec,72℃1min,31個循環(huán);再在72℃延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,在電泳凝膠成像分析儀上照相,以各目標產(chǎn)物灰度值×面積與GAPDH產(chǎn)物的灰度值×面積的比值表示該指標的相對表達量。 四、統(tǒng)計分析
9、 實驗結果用-x±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD法,檢驗水準α=0.05。 結果: 一、各組大鼠一般狀況及體重變化 實驗期間,除橄欖油Ⅱ組有一只大鼠死亡外,其余各組大鼠生長發(fā)育基本正常,未見異常表現(xiàn)。各組大鼠體重增量、攝食量和飼料效價間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 二、各組大鼠血脂水平 比較各組大鼠血TC、LDL-C水平,均以橄欖油Ⅲ組
10、最高。在TC水平上,豬油組、橄欖油Ⅰ組、橄欖油Ⅱ組、橄欖油Ⅲ組均明顯高于基礎組(P<0.05);橄欖油Ⅱ組、橄欖油Ⅲ組的LDL-C水平也明顯高于基礎組(P<0.05),橄欖油Ⅲ組LDL-C水平還高于豬油組(P<0.05)。比較各組HDL-C水平,橄欖油Ⅱ組、橄欖油Ⅲ組低于基礎組(P<0.05),橄欖油III組低于豬油組(P<0.05)。在TG水平上,以橄欖油Ⅱ組最高,與基礎組的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 三、各組大鼠肝
11、指數(shù)和內(nèi)臟脂肪/體重比值 與基礎組比較,其他各組大鼠肝指數(shù)均有升高(P<0.05);橄欖油Ⅲ組大鼠各部位脂肪體比均低于其他各組,但其間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);橄欖油Ⅰ組、Ⅱ組大鼠睪周脂肪/體重、腸系膜脂肪/體重、內(nèi)臟脂肪/體重高于基礎組大鼠的相應指標,其間差異具有統(tǒng)計學意義( P<0.05)。 四、各組大鼠肝臟病理改變 觀察各組大鼠肝臟大體標本,基礎組大鼠肝臟顏色鮮紅,邊緣銳利,質(zhì)地柔軟,而其它各組大鼠
12、的肝臟呈土黃色,邊緣變鈍,質(zhì)地變硬,切面呈油膩感。由各組大鼠肝臟切片可見:基礎組大鼠肝細胞形態(tài)正常,豬油組大鼠的肝臟中均有少數(shù)肝細胞發(fā)生了脂肪變,但尚未達到脂肪肝的程度。不同劑量的橄欖油組大鼠均呈現(xiàn)出輕度脂肪肝的改變。 五、各組大鼠肝臟中HMG-CoA reductase和CYP7A1 mRNA的相對表達量 各組大鼠肝臟中HMG-CoA reductase mRNA和CYP7A1 mRNA相對表達量的差異均無統(tǒng)計學意義(
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