高膽固醇血癥對缺血后適應(yīng)心肌保護作用的影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　在心肌缺血發(fā)生后，對缺血部位的心肌進行及時有效的血液再灌注是目前公認的阻止心肌壞死的最佳途徑。然而，再灌注本身卻有可能會加劇缺血后心肌細胞的損傷，即發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。隨著冠狀動脈介入治療等再灌注療法被廣泛用于臨床冠心病治療，如何有效預(yù)防和減輕MIRI已成為國內(nèi)外學(xué)者們爭相研究的熱點問題。
　　缺血后適應(yīng)或缺血后處理(i

2、schemic postcondioning，IPoC)是一種能發(fā)揮強大內(nèi)源性心肌保護作用的措施，它在長時間再灌注開始前，通過預(yù)先對心肌進行短暫、反復(fù)的缺血/灌注干預(yù)，提高心肌對缺血的耐受性，從而減輕MIRI。IPoC的心肌保護作用相當?shù)膹V泛，它可以抑制缺血誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和壞死，有效降低MIRI過程中惡性心律失常的發(fā)生率，減少細胞和線粒體內(nèi)鈣蓄積，增加心肌抗氧化能力，改善MIRI過程中心肌無復(fù)流現(xiàn)象，促進心功能的早期恢復(fù)。IPoC的

3、心肌保護作用機制主要是通過促使機體在局部釋放促發(fā)劑（如腺苷、緩激肽），從而激活相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvagekinase，RISK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（包括PI3K-Akt、Raf-MEK1/2-ERK1/2信號通路），最終通過調(diào)控終末效應(yīng)器線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔道(mitochondrial permeabilitytransition pore，MPTP)的開放來實現(xiàn)其心肌保護作用

4、。
　　IPoC的心肌保護作用已經(jīng)在多種健康的實驗動物身上得到了證實，然而，對于IPoC能否在臨床上有效減輕冠心病患者MIRI目前仍存在較大的爭議。特別是最近多項大樣本的隨機對照臨床試驗的結(jié)果顯示，對于進行PCI手術(shù)治療的急性心肌梗死患者，IPoC無法有效預(yù)防MIRI。目前認為IPoC心肌保護作用在臨床患者身上受到抑制的主要原因是患者本身基礎(chǔ)條件極為復(fù)雜，尤其是存在有高膽固醇血癥、糖尿病、心肌肥大等多種并發(fā)癥，而這些并發(fā)癥的存在極

5、有可能抑制了IPoC的心肌保護作用。
　　目前對于IPoC能否在高脂血癥（尤其是高膽固醇血癥）動物身上發(fā)揮心肌保護作用目前存在有較大的爭議。一部分研究者認為高膽固醇血癥會阻礙IPoC發(fā)揮心肌保護作用，而另一部分研究者則認為高膽固醇血癥并不影響IPoC發(fā)揮心肌保護作用，甚至有學(xué)者提出高膽固醇血癥能促進缺血部位心肌功能的恢復(fù)。而我們的前期實驗結(jié)果顯示，對于高膽固醇血癥大鼠，IPoC不能減少心肌梗死的面積，提示IPoC作用可能受到高膽固

6、醇血癥的干擾。鑒于以上具有爭議的結(jié)果，我們需要更為全面地評價IPoC對高膽固醇血癥大鼠的心肌保護作用，并進一步探索其中的機制。
　　基于已有的相關(guān)文獻報道和前期工作基礎(chǔ)，本課題開展了以下三個方面的研究:(1)通過構(gòu)建高膽固醇血癥大鼠IPoC模型，觀察并比較正常組和高膽固醇血癥組IPoC作用的差異，明確高膽固醇血癥是否阻礙IPoC心肌保護作用;(2)觀察并比較正常和高膽固醇血癥IPoC心肌中MPTP開放情況、MPTP上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

7、及下游凋亡相關(guān)因子的激活情況，揭示高膽固醇血癥阻礙IPoC心肌保護效應(yīng)的下游靶點及具體機制;(3)應(yīng)用MPTP開放特異性抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporine A，CSA)進行干預(yù)，觀察CSA能否恢復(fù)IPoC對高膽固醇血癥大鼠心肌的保護作用。
　　方法：
　　1、對健康雄性的Wistar大鼠進行為期8周的高膽固醇飲食喂養(yǎng)，經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，應(yīng)用全自動生化分析儀檢查血清中總膽固醇(total cholesterol

8、，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDL)含量來鑒定高膽固醇血癥大鼠模型是否成功制備。
　　2、應(yīng)用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)通過全心缺血30min，再灌注120min來制備大鼠離體心臟MIRI模型，通過在再灌注開始初期對心臟實施6或12個循環(huán)的10s缺血/10

9、s再灌注的干預(yù)來制備心臟IPoC模型。0.5或5μmol CSA于缺血前15min經(jīng)Langendorff裝置側(cè)管給藥，給藥速度8ml/min，給藥時間15min。
　　3、應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠心肌亞顯微結(jié)構(gòu)變化情況。
　　4、HE染色法觀察大鼠心肌顯微結(jié)構(gòu)變化情況。
　　5、TTC染色法觀察大鼠心肌梗死范圍。
　　6、TUNEL染色法觀察大鼠心肌細胞凋亡情況。
　　7、比色法檢測灌流液中心肌酶(CK-MB

10、和LDH)含量來評估大鼠心肌損傷程度。
　　8、比色法檢測心肌組織中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide，NAD)含量來分析心肌中MPTP的開放情況。
　　9、Western blot方法檢測RISK信號通路以及MPTP下游凋亡相關(guān)蛋白表達的變化情況
　　10、統(tǒng)計分析:兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多個樣本間比較則先采取單因素方差分析方法進行分析，若組間存在統(tǒng)計學(xué)差異

11、則進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、血脂測定結(jié)果顯示，經(jīng)過為期8周的高膽固醇飲食喂養(yǎng)后，高膽固醇飲食喂養(yǎng)組的大鼠血中TC和LDL含量較正常飲食喂養(yǎng)組大鼠呈現(xiàn)顯著的升高，說明高膽固醇血癥大鼠模型制備成功。
　　2、正常IPoC組較缺血再灌注損傷組心肌亞顯微結(jié)構(gòu)和顯微結(jié)構(gòu)損傷程度更輕，同時心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率也顯著的減少。而高膽固醇血癥IPoC組較高膽固醇

12、血癥缺血再灌注損傷組心肌亞顯微結(jié)構(gòu)和顯微結(jié)構(gòu)損傷程度并沒有明顯的減輕，且心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率也無明顯減少。
　　3、正常IPoC組心肌組織中NAD的含量較正常缺血再灌注損傷組呈現(xiàn)顯著升高，而高膽固醇血癥IPoC組心肌組織中NAD的含量與高膽固醇血癥缺血再灌注損傷組之間無明顯的差異。
　　4、正常IPoC組心肌組織中P-Akt、P-ERK1/2、P-GSK-3β的蛋白表達水平分別較正常缺血再灌注損傷組心肌組織呈現(xiàn)顯著升

13、高，而高膽固醇血癥IPoC組心肌組織中P-Akt、P-ERK1/2、P-GSK-3β的蛋白表達水平與高膽固醇血癥缺血再灌注損傷組心肌組織之間無明顯的差異，除此之外，所有實驗組之間總的Akt、ERK1/2、GSK-3β蛋白表達水平無明顯的差異。
　　5、正常IPoC組心肌組織較正常缺血再灌注損傷組心肌組織中Bax、Cytochrome C、Caspase9、caspase3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax

14、比率明顯升高;而高膽固醇血癥IPoC組心肌組織較高膽固醇血癥缺血再灌注損傷組心肌組織中以上凋亡相關(guān)蛋白表達均無明顯的差異。
　　6、在高膽固醇血癥大鼠實驗組中，0.5μmol CSA聯(lián)合IPoC干預(yù)組的心肌梗死面積、CK-MB和LDH釋放量較缺血再灌注損傷組呈現(xiàn)明顯的減少。而分別單獨應(yīng)用0.5μmol CSA或IPoC進行干預(yù)時，心肌梗死面積及CK-MB和LDH的釋放量無明顯減少。此外，更大劑量的CSA（5μmol）和12次循環(huán)的