Dsg3刺激下尋常型天皰瘡患者外周血T淋巴細胞增殖檢測分析.pdf

1、尋常型天皰瘡(Pemphigus vulgaris，PV)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、大皰性皮膚病，主要表現(xiàn)為皮膚及粘膜上出現(xiàn)極易破裂的水皰，其病理基礎(chǔ)是棘層細胞松解，細胞間粘連的喪失，發(fā)生這種病理改變的直接原因是PV患者體內(nèi)存在局部的或循環(huán)的IgG型自身抗體，該抗體與角質(zhì)形成細胞(keratinocyte，KC)表面的抗原分子結(jié)合后作用于橋粒中的一種糖蛋白——橋粒芯糖蛋白3(desmoglein3，Dsg3)，導(dǎo)致細胞間粘附能力喪失，而導(dǎo)致P

2、V的發(fā)生。這種病變可以通過被動轉(zhuǎn)移患者的IgG給新生小鼠而重現(xiàn)，說明體液免疫在PV的發(fā)生過程中起重要作用。隨著免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究結(jié)果表明T淋巴細胞在PV發(fā)病過程中也起著重要的作用。除分泌各種細胞因子直接參與疾病的發(fā)生發(fā)展之外，Th2細胞在識別MHC II類抗原、B細胞激活、抗體產(chǎn)生以及靶器官的破壞等各個方面均起重要作用。 本實驗采用流式細胞儀四熒光染色法檢測Dsg3刺激下PV患者外周血Th1和Th2

3、型T淋巴細胞表達水平的變化；采用5-BrdU摻入法檢測CD4+T淋巴細胞的增殖情況，初步探討尋常型天皰瘡患者發(fā)病與自身反應(yīng)性T淋巴細胞活化與增殖之間的關(guān)系。 材料和方法 一、病例和主要試劑 1、PV患者組 PV患者12人，均為中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科住院患者，所有病例均經(jīng)臨床、組織病理及免疫病理證實為尋常型天皰瘡；健康獻血者22名作為正常對照。 2、標本的采集與處理 采研究對象外周

4、靜脈血10ml，EDTA-k抗凝后8小時內(nèi)提取外周血單個核細胞(PMBC)。 3、Dsg3來源 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HELA細胞株。 4、主要試劑 淋巴細胞分離液、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清，為Hyclone公司產(chǎn)品；植物血凝素(PHA)為Sigrna公司產(chǎn)品；熒光標記抗體(抗人CD3-APC、抗人CD4-PECy5、抗人IL-4-PE、抗人IFN-γ-FITC)、Cytofix/CytopermTM Plu

5、s Fixation/PermeabilizationKit、FITC BrdU Flow Kit、BD GolgiStopTM、24孔培養(yǎng)板均購自BD公司；Ni-NTApurification system、G418(Geneticin)為Invitrogen公司產(chǎn)品；一次性濾器(0.22μm)為Millipore公司產(chǎn)品。 5、主要儀器和設(shè)備 流式細胞儀，F(xiàn)ACS Calibur，ND1000，(BD公司，美國)；A

6、KTA purifior(通用公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱(Harris HW0301 T-VBA型，德國)；低溫離心機(日立，日本)；超凈工作臺(國產(chǎn))。 二、實驗方法 1、尋常型天皰瘡抗原Dsg3的獲得； 2、外周血單個核細胞(PBMC)的提??； 3、T淋巴細胞的活化及分組培養(yǎng)： 空白對照陰性對照實驗組陽性對照 PBMC PBMC PBMC+Dsg3 PBMC+PHA 4、培養(yǎng)

7、后Th1/Th2型T淋巴細胞的測定； 5、5-BrdU摻入法檢測CD4+T淋巴細胞的增殖。 實驗結(jié)果 一、培養(yǎng)后各組Th1/Th2型T淋巴細胞的測定結(jié)果 1、Dsg3刺激下PV患者的Th2型T淋巴細胞比例高于不加任何刺激的陰性對照組； 2、Dsg3刺激下PV患者的Th1型T淋巴細胞比例與不加任何刺激的陰性對照組比較無明顯差異； 3、在Dsg3刺激下，PV患者Th2型T淋巴細胞比例顯著高于正

8、常人； 4、在Dsg3刺激下，PV患者Th1型T淋巴細胞比例低于正常人； 5、未經(jīng)任何刺激時，PV患者Th2型T淋巴細胞比例顯著高于正常人； 6、未經(jīng)任何刺激時，PV患者Th1型T淋巴細胞比例低于正常人。 二、5-BrdU摻入法檢測CD4+T淋巴細胞增殖的結(jié)果 1、PV患者在Dsg3刺激后發(fā)生增殖的CD4+T淋巴細胞顯著高于正常人； 2、PV患者在Dsg3刺激后發(fā)生增殖的CD4+T細胞高于