黃芪甲苷單體與藥材的藥動學(xué)差異及單體對血管平滑肌細胞A10影響的分子機制.pdf

1、一、研究背景：
　　 黃芪是中醫(yī)補氣的重要藥物。大量的現(xiàn)代研究表明,黃芪可從多方面作用于機體,改善心血管、腦血管、糖尿病、腎病等相關(guān)血管性病變患者的血流動力學(xué)和血管功能。黃芪主要成分及其組方對動脈粥樣硬化的防治有較好療效[1],尤其對于氣虛血瘀型的心臟疾病,既能補氣又能活血，如在補陽還五湯中,黃芪配伍活血化瘀藥用于一些心血管系統(tǒng)的疾病,體現(xiàn)了一定的“活血”作用。
　　 因為豐富的用藥經(jīng)驗和可靠的療效，黃芪的化學(xué)成分研究、

2、藥理學(xué)研究等進行的比較深入；體內(nèi)外分析研究、在細胞或分子層面的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究等，有所涉及。但由于某些指標(biāo)成分如黃芪甲苷本身的分析檢測難度，使得對黃芪的體內(nèi)過程研究特別是大動物體內(nèi)研究還有待深入，特別是在此基礎(chǔ)上的，針對黃芪治療氣虛血瘀等心血管疾病的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究少有報道。進一步地，對以重要成分黃芪甲苷為代表的細胞或分子層面的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚待進行。
　　 在對臨床效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)和黃芪制劑的深度研發(fā)過程中，以單一成分的研究一

3、般不能完全代表整藥材或復(fù)方中的研究結(jié)論。但作為一種研究手段，利用先進的分析檢測條件，選擇藥材中的某一種或幾種代表性成分進行研究，仍然是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的一個好的切入點，特別是在探索性的研究中更具有積極意義。
　　 二、研究目的:
　　 從黃芪中的重要化學(xué)成分之一----黃芪甲苷入手，探討以黃芪甲苷單體為代表的藥物體內(nèi)過程，并研究單體與藥材是否存在藥動學(xué)差異，為臨床應(yīng)用和深度制劑開發(fā)提供參考；在此基礎(chǔ)上，作為探索性研究，以

4、對動脈粥樣硬化密切關(guān)聯(lián)的血管平滑肌細胞為實驗對象，探討黃芪甲苷對血管平滑肌細胞A10 增殖、凋亡的影響，并進一步研究其分子機制，為闡述黃芪調(diào)理氣機、預(yù)防心血管疾病如動脈粥樣硬化等的物質(zhì)基礎(chǔ)尋找理論依據(jù)。
　　 三、研究內(nèi)容研究內(nèi)容主要分為三個部分，分述如下。
　　 第一部分：黃芪甲苷在Beagle 犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)和絕對生物利用度研究摘
　　 目的:建立Beagle犬血漿中黃芪甲苷血藥濃度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分

5、析方法（HPLC-MS），檢測Beagle犬靜脈注射及口服黃芪甲苷后血漿中黃芪甲苷的濃度經(jīng)時過程，研究黃芪甲苷在Beagle犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)和絕對生物利用度，為臨床研究及黃芪制劑的深度開發(fā)提供實驗參考。
　　 方法(Ⅰ) 絕對生物利用度的研究：Beagle犬10只（雌雄各半，11.0±0.7 kg）隨機分為A, B兩組，每組5只，實驗給藥前12 h禁食不禁水，采用單劑量雙周期灌胃（5 mg/kg）和靜脈給藥（0.5 mg/kg

6、，中劑量）交叉實驗。第一周期A組5只Beagle犬灌胃給藥，B組靜脈給藥；實驗間隔一周（洗脫期）后，第二周期兩組交叉，B組灌胃給藥，A組靜脈給藥(實驗給藥前12 h禁食不禁水，服藥4h 后統(tǒng)一進食)。灌胃給藥，于給藥前及給藥后15 min, 30 min, 45 min,60 min, 90min, 120 min, 180 min, 240 min, 360 min, 480 min, 720min和1440 min, 犬前肢靜脈采集

7、血液約2 ml, 肝素抗凝，離心得血漿；靜脈給藥，于給藥前及給藥后2 min, 10 min, 20 min, 30 min,45 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, 240 min, 360 min和720 min，犬前肢對側(cè)靜脈采集血液約2ml, 肝素抗凝，離心得血漿。
　　 采用固相萃取富集犬血漿中的黃芪甲苷，然后用HPLC-MS聯(lián)用系統(tǒng)，分離測定血漿樣品中的黃芪甲苷濃度，用3p9

8、7軟件擬合求算藥代動力學(xué)參數(shù)并計算絕對生物利用度。(Ⅱ)藥代動力學(xué)研究：Beagle犬10只（雌雄各半，11.9±0.8 kg）隨機分為兩組，每組5只，每組別分別按0.17mg/kg（低劑量）和1.5 mg/kg（高劑量）靜脈注射給藥(所有犬實驗給藥前12 h禁食不禁水，服藥4 h 后統(tǒng)一進食)。于給藥前及給藥后2 min, 10 min, 20 min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min,120 min,

9、180 min, 240 min, 360 min和720 min，犬前肢靜脈采集血液約2ml, 肝素抗凝，離心得血漿采用固相萃取富集犬血漿中的黃芪甲苷，然后用HPLC-MS聯(lián)用系統(tǒng)，分離測定血漿樣品中的黃芪甲苷濃度，用3p97軟件擬合求算藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究建立的HPLC-MS的方法靈敏度高,最低檢測限0.5ng/mL,雜質(zhì)干擾小,操作簡便,是一種檢測大動物體內(nèi)黃芪甲苷的有效分析方法。

10、>　　 2、按低、中、高劑量iv黃芪甲苷后，藥物的半衰期基本相近，AUC隨著iv劑量的增加存在明顯劑量依賴性，說明在本研究的劑量范圍內(nèi)，黃芪甲苷在犬體內(nèi)清除符合線性動力學(xué)過程。3、通過絕對生物利用度的研究顯示，黃芪甲苷在犬體內(nèi)絕對生物利用度很低，為2.62％。
　　 第二部分：黃芪藥材及黃芪甲苷單體在Beagle 犬體內(nèi)藥代動力學(xué)差異的研究
　　 目的:Beagle犬分別灌胃黃芪藥材及黃芪甲苷單體后，測定體內(nèi)黃芪甲苷的

11、血藥濃度，繪制平均血藥濃度-時間曲線，分別求算黃芪甲苷的藥代動力學(xué)參數(shù)（用3p97軟件擬合求算藥代動力學(xué)參），并比較它們之間的主要藥代動力學(xué)的差異。
　　 方法:10只Beagle犬，隨即分成兩組，分別灌胃黃芪藥材及黃芪甲苷單體（相當(dāng)于5 mg/kg），于給藥前及給藥后15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 120 min, 180min, 240 min, 360 min, 480 min, 720 m

12、in和1440 min取血，LC/MS測定血藥濃度，用3p97軟件擬合求算藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)論:黃芪藥材給藥和黃芪甲苷單體給藥比較，Tmax明顯提前，Cmax顯著增高，AUC明顯提高，提示黃芪藥材中的某些成分能提高黃芪甲苷的體內(nèi)吸收。
　　 第三部分：黃芪甲苷誘導(dǎo)鼠血管平滑肌細胞A10凋亡伴隨Ca2+濃度升高及ERK/MAPK的激活
　　 目的:黃芪甲苷的藥理學(xué)研究表明其具有降壓，正性肌力，抗炎，鎮(zhèn)痛，鎮(zhèn)

13、靜，保肝，神經(jīng)系統(tǒng)保護，抗心肌梗塞和抗病毒等功效。黃芪甲苷現(xiàn)在已經(jīng)被作為一種心血管保護劑用于治療心血管疾病。在本部分實驗中，研究了黃芪甲苷對鼠（主動脈）血管平滑肌細胞A10的影響。
　　 方法:細胞活力的測定采用cck-8 法，凋亡采用流式細胞儀來測定（包括PI單染和Annexin V/PI 雙染）及DNA ladder片斷法確定。細胞內(nèi)Ca2+濃度的測定以Fura-3/AM為熒光探針采用激光共聚焦的方法來測定，相關(guān)蛋白表達采用

14、免疫印跡的方法來測定。
　　 結(jié)論:黃芪甲苷能誘導(dǎo)A10細胞凋亡其中Ca2+及ERK/MAPK在凋亡信號通路中扮演重要角色。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.建立了血漿中黃芪甲苷血藥濃度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法（HPLC-MS），靈敏度高,最低檢測限0.5ng/mL,操作簡便,是一種檢測大動物體內(nèi)黃芪甲苷的有效分析方法。
　　 2．按低、中、高劑量iv黃芪甲苷后，藥物的半衰期基本相近，AUC隨著iv劑量的

15、增加存在明顯劑量依賴性，說明在本研究的劑量范圍內(nèi)，黃芪甲苷在犬體內(nèi)清除符合線性動力學(xué)過程。
　　 3．通過對口服給與黃芪藥材及黃芪甲苷單體藥代動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪藥材及黃芪甲苷單體在體內(nèi)的藥動學(xué)行為存在一定差異。
　　 4．黃芪甲苷對血管平滑肌細胞A10 增殖、凋亡的影響可以特征地予以檢測和識別。
　　 研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷對血管平滑肌細胞A10 增殖抑制的影響呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。其在一定時間和濃度

16、條件下所導(dǎo)致的凋亡發(fā)生，通過Hoechst 33258 染色、PI 單染、Annexin V-PI 雙染法、DNA Ladder 實驗等可以特征地予以檢測和識別。
　　 5．對血管平滑肌細胞增殖、凋亡影響的進一步分子機制研究，結(jié)果表明，增殖的抑制和凋亡的誘導(dǎo)發(fā)生，可能是對caspase 3的酶活力增強所至，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。本研究證明了黃芪甲苷能提高caspase 3活性。
　　 在影響增殖和凋亡的分子機制

17、的研究中，對最重要的第二信使之一--鈣信號進行了測定。本研究表明黃芪甲苷誘發(fā)了細胞內(nèi)Ca2+升高，并且可能導(dǎo)致下游一系列信號途徑產(chǎn)生細胞凋亡。
　　 2．按低、中、高劑量iv黃芪甲苷后，藥物的半衰期基本相近，AUC隨著iv劑量的增加存在明顯劑量依賴性，說明在本研究的劑量范圍內(nèi)，黃芪甲苷在犬體內(nèi)清除符合線性動力學(xué)過程。
　　 3．通過對口服給與黃芪藥材及黃芪甲苷單體藥代動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪藥材及黃芪甲苷單體在體內(nèi)的藥動學(xué)

18、行為存在一定差異。
　　 4．黃芪甲苷對血管平滑肌細胞A10 增殖、凋亡的影響可以特征地予以檢測和識別。
　　 5．對血管平滑肌細胞增殖、凋亡影響的進一步分子機制研究，結(jié)果表明，增殖的抑制和凋亡的誘導(dǎo)發(fā)生，可能是對caspase 3的酶活力增強所至，且呈現(xiàn)出濃度依賴性和時間依賴性。本研究證明了黃芪甲苷能提高caspase 3活性。
　　 本文亦對影響增殖和凋亡的另一信號通路MAPK進行了研究。在本研究的Weste