劍尾魚HSP70家族兩成員的分子克隆及溶藻弧菌感染與免疫對其基因的誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是一類存在于所有生物體包括魚類細(xì)胞內(nèi)比較保守的蛋白，在遇到外界刺激時(shí)，能誘導(dǎo)或增強(qiáng)其表達(dá)，以保護(hù)細(xì)胞免受損害。即使在正常無應(yīng)激情況下，許多HSPs也起著維護(hù)細(xì)胞正常功能的作用。目前主要根據(jù)分子量大小對HSPs進(jìn)行分類，其中對HSP90、HSP70和低分子量HSPs(16-24kDa)研究較為廣泛。HSP70作為分子伴侶在協(xié)助新生多肽鏈折疊，蛋白質(zhì)復(fù)合體的裝配，以及調(diào)節(jié)、修護(hù)和降解變性的蛋白質(zhì)方面起著重要作用。研究證

2、明一些熱應(yīng)激蛋白可以作為指標(biāo)測定魚類的應(yīng)激狀態(tài)。魚體在受到外界環(huán)境因子脅迫時(shí)，會(huì)生成大量的熱應(yīng)激蛋白，這些因素包括工業(yè)處理水、重金屬離子、亞砷酸鹽及寄生蟲等環(huán)境因子。 作為一類存在于包括魚類在內(nèi)的所有生物體細(xì)胞比較保守的蛋白，熱應(yīng)激蛋白在免疫學(xué)方面的應(yīng)用價(jià)值也正日益受到人們的關(guān)注。研究表明，人類的許多疾病與人體內(nèi)熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。由于熱應(yīng)激蛋白參與了生物的多種免疫應(yīng)答過程，因此，外界刺激誘導(dǎo)生物機(jī)體產(chǎn)生熱應(yīng)激蛋白，能夠增

3、強(qiáng)生物對某些破壞性因子的抗性。一些病原體內(nèi)的熱應(yīng)激蛋白尤其是HSP70家族成員具有很強(qiáng)的免疫原性，是免疫系統(tǒng)的主要靶分子。HSP70在瘧原蟲、錐體蟲、血吸蟲、利什曼原蟲和分支桿菌的感染中起重要的產(chǎn)生免疫原性的作用。真菌中的結(jié)節(jié)型組織胞漿菌的一HSP70家族成員是細(xì)胞免疫的主要靶子。HSP70是含量最豐富的一大家族HSPs,具有高度保守的序列以及在受到環(huán)境脅迫后能夠大量表達(dá)，因此以熱應(yīng)激蛋白70作為指標(biāo)來測定魚類的應(yīng)激狀態(tài)，包括感染或免疫

4、狀態(tài)可能是較為理想的選擇。 本研究的目的是以溶藻弧菌為代表病原菌，以標(biāo)準(zhǔn)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚(Xiphophorushelleri)為實(shí)驗(yàn)對象，在病原菌感染或免疫處理后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別無菌采取肝臟、心臟、頭腎和脾臟組織，從mRNA表達(dá)水平上了解劍尾魚HSP70基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。在不同時(shí)間點(diǎn)，取脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)，檢測劍尾魚淋巴細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素-2活性。以期找出HSP70基因表達(dá)與劍尾魚病原菌感染與免疫狀態(tài)的關(guān)系。HSP7

5、0的基因表達(dá)采用半定量RT-PCR方法，淋巴細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素-2活性采用MTT法。結(jié)果表明： 1.弧菌中的一種感染性較強(qiáng)的溶藻弧菌能感染劍尾魚，半數(shù)致死量為2.0×108CFU/g。 2.由于目前并無劍尾魚HSP70基因序列的相關(guān)報(bào)道，本文首次得到了劍尾魚HSP70兩個(gè)成員基因的部分序列。采用RT-PCR方法擴(kuò)增了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劍尾魚(Xiphophorushelleri)純系RR-B的HSP70家族兩個(gè)新成員的cDNA片

6、段，并將其克隆到PMD18-T載體中測序，將測序結(jié)果與GeneBank中的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。利用RT-PCR半定量方法研究了熱應(yīng)激對兩成員在劍尾魚組織中的表達(dá)?？寺～@得了劍尾魚HSP70家族兩成員的cDNA片段，兩序列均包含HSP70家族的特征性簽名序列和熱休克蛋白的定位序列；通過對克隆片段與已發(fā)表的青鳉等魚類HSP70的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列同源性很高，成員一和成員二分別達(dá)到

7、85％-89％和82％-99％，氨基酸序列同源性更高，成員一和成員二分別達(dá)到97％-99％和93％-99％。一般條件下，兩成員在劍尾魚肝臟、脾臟、頭腎和心臟中不表達(dá)，熱應(yīng)激能刺激成員一在劍尾魚脾臟中表達(dá)，成員二在肝臟、脾臟、頭腎和心臟中強(qiáng)烈表達(dá)。熱應(yīng)激能誘導(dǎo)兩成員的表達(dá)，并且得到的劍尾魚HSP70兩成員均具有核定位信號(hào)序列，推測其可能為誘導(dǎo)表達(dá)的HSP70，、而不是組成性表達(dá)的HSC70。成員二可能在參與熱應(yīng)激保護(hù)方面起更大作用。

8、 3.許多環(huán)境應(yīng)激能誘導(dǎo)HSP70在魚類體內(nèi)的表達(dá)，但有關(guān)病原菌感染對其表達(dá)影響并不清楚。本文利用半定量RT-PCR研究了溶藻弧菌感染對HSP70兩成員在劍尾魚肝胰臟、脾臟、心臟和頭腎組織中的基因表達(dá)。活魚樣品在感染前后五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，并與感染致死魚樣品內(nèi)HSP70兩成員基因表達(dá)相比較。結(jié)果表明，正常條件下，HSP70兩成員在組織中均不表達(dá)。劍尾魚同樣受到溶藻弧菌感染時(shí)，不同HSP70表現(xiàn)出不同的基因誘導(dǎo)表達(dá)情況，只有在溶藻弧菌感染相

9、當(dāng)嚴(yán)重以至于死亡時(shí)，才能誘導(dǎo)HSP70成員一在劍尾魚脾臟中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，HSP70成員二在劍尾魚肝臟、脾臟、頭腎和心臟中均有不同程度的誘導(dǎo)，說明HSP70成員二更有可能參與較強(qiáng)的抗感染過程。溶藻弧菌感染后，在劍尾魚肝胰臟內(nèi)，直到感染后第8天，HSP70成員二基因才強(qiáng)烈的被誘導(dǎo)表達(dá)，HSP70/β-actin比值達(dá)到1.80±0.03，感染致死魚肝胰臟內(nèi)未見表達(dá)。頭腎內(nèi)，除感染第8天誘導(dǎo)HSP70成員二基因強(qiáng)烈表達(dá)，第2、5天也有HSP70

10、成員二基因表達(dá)，感染致死魚頭腎內(nèi)也檢測到HSP70成員二基因的強(qiáng)烈表達(dá)，HSP70/β-actin比值分別為2.00±0.06，0.35±0.02，0.15±0.01和0.95±0.05。而脾臟內(nèi)，在溶藻弧菌感染2、5、8天檢測到HSP70成員二基因表達(dá)，未在第11天檢測到HSP70成員二表達(dá)，感染致死魚脾臟內(nèi)檢測到HSP70成員二基因的強(qiáng)烈表達(dá)。僅感染致死魚心臟中表現(xiàn)HSP70成員二表達(dá)，未在活魚心臟內(nèi)檢測到其表達(dá)。與溶藻弧菌感染后第

11、2天開始誘導(dǎo)劍尾魚脾臟HSP70成員二的轉(zhuǎn)錄表達(dá)比較，此時(shí)淋巴細(xì)胞增殖活性與對照組無顯著差異。在感染后8～17天，淋巴細(xì)胞增殖活性極顯著高于對照組(P＜0.01)；白細(xì)胞介素-2活性在感染后2～8天極顯著高于對照組(P＜0.01)。由于頭腎和脾臟是魚類重要的免疫器官，HSP70成員二首先在兩器官中被誘導(dǎo)表達(dá)，說明HSP70可能較早參與了抗感染免疫。 4.利用半定量RT-PCR研究了溶藻弧菌滅活疫苗接種后對HSP70兩成員在劍尾魚

12、肝胰臟、脾臟、心臟和頭腎組織中的基因表達(dá)。結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)HSP70成員一在劍尾魚的脾臟、肝臟、心臟和頭腎中誘導(dǎo)基因表達(dá)。在免疫后第5天脾臟內(nèi)即開始誘導(dǎo)表達(dá)HSP70成員二，這時(shí)，脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性沒有顯著增強(qiáng)，與對照組差異不顯著。頭腎內(nèi)HSP70成員二誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的更早，免疫第2天就能誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。在劍尾魚肝臟和心臟中未發(fā)現(xiàn)HSP70成員二的基因表達(dá)。這也強(qiáng)調(diào)了劍尾魚脾臟和頭腎在免疫中的重要作用。利用淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT檢測法對接

13、種溶藻弧菌滅活疫苗劍尾魚的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)劍尾魚在接種溶藻弧菌滅活疫苗后第8～14天T細(xì)胞增殖活性顯著高于對照組(P＜0.01)。通過劍尾魚脾細(xì)胞在體外有絲裂素的存在下可以增殖并表達(dá)IL-2，并且溶藻弧菌滅活免疫的劍尾魚脾細(xì)胞能增強(qiáng)IL-2活性，在接種后第5～14天IL-2活性顯著高于對照組(P＜0.01)。綜合結(jié)果表明：溶藻弧菌感染或滅活疫苗免疫在引起IL-2活性增強(qiáng)的同時(shí)，誘導(dǎo)HSP70成員二在劍尾魚免疫組織