江蘇地區(qū)斑潛蠅發(fā)生危害及三葉斑潛蠅HSP70家族基因克隆與表達(dá).pdf

1、斑潛蠅屬Liriomyza隸屬于雙翅目Diptera、潛蠅科Agromyzidae、植潛蠅亞科Phytomyzidae。斑潛蠅種類繁多，種間競(jìng)爭(zhēng)與替代迅速，不斷向世界各地蔓延危害。三葉斑潛蠅Liriomyza trifolii，美洲斑潛蠅Liriomyza sativae和南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis是入侵我國(guó)危害嚴(yán)重的三種多食性斑潛蠅。近年的調(diào)查顯示，在江蘇地區(qū)發(fā)生危害的主要是美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅，未發(fā)現(xiàn)南

2、美斑潛蠅的危害。此外，物種對(duì)溫度脅迫的耐受能力與其它因素一起決定它們的生存、分布、競(jìng)爭(zhēng)和擴(kuò)散。熱激蛋白被認(rèn)為是與昆蟲(chóng)溫度耐受性關(guān)系最密切的一類蛋白質(zhì)，其中熱激蛋白70(HSP70)家族與溫度脅迫的關(guān)系最為密切，而有關(guān)三葉斑潛蠅的HSP70研究甚少。本研究于2014-2016年對(duì)江蘇地區(qū)斑潛蠅發(fā)生危害情況進(jìn)行了調(diào)查;同時(shí)克隆了三葉斑潛蠅的4條HSP70基因，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了研究，同時(shí)還與其近緣斑潛蠅種類的HSP70基因進(jìn)行比較，從分子

3、水平上揭示其抗逆境和生態(tài)適應(yīng)能力，為闡明其入侵及成災(zāi)機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、2014-2016年連續(xù)三年對(duì)江蘇地區(qū)斑潛蠅的發(fā)生危害進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明:江蘇地區(qū)主要發(fā)生危害的是美洲斑潛蠅和三葉斑潛蠅，且美洲斑潛蠅主要在蘇北地區(qū)發(fā)生危害，三葉斑潛蠅主要在蘇南蘇中地區(qū)發(fā)生危害，兩種斑潛蠅共同發(fā)生危害的區(qū)域主要集中在蘇中和沿江的部分地區(qū)。此外，不論在寄主種類、危害程度還是危害面積上，三葉斑潛蠅較美洲斑潛蠅具有更大的

4、競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，而且揚(yáng)州地區(qū)三葉斑潛蠅基本取代美洲斑潛蠅，成為該地區(qū)蔬菜上的優(yōu)勢(shì)種斑潛蠅，同時(shí)三葉斑潛蠅在揚(yáng)州地區(qū)全年有3個(gè)發(fā)生危害高峰，其中8月上中旬的種群數(shù)量最大。
　　2、采用RT-PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)，從三葉斑潛蠅中克隆得到4條HSP70基因，分別為L(zhǎng)thsc70、Lthsp701、Lthsp702和Lthsp703。4條熱激蛋白基因cDNA序列全長(zhǎng)分別為233

5、2、2261、2078和2296 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度分別為1956、1938、1899和1923 bp，分別編碼651、645、632和640個(gè)氨基酸，同時(shí)這4個(gè)熱激蛋白都具有HSP70家族的典型結(jié)構(gòu)域。序列分析發(fā)現(xiàn)，這4條Lthsp70s與其它物種的hsp70具有很高的相似性，并在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上被歸為兩類。通過(guò)比對(duì)基因組序列和cDNA序列發(fā)現(xiàn)，Lthsp701、Lthsp702和Lthsp703均不含有內(nèi)含子，而Lthsc70含有1個(gè)

6、內(nèi)含子，長(zhǎng)度為1273bp，內(nèi)含子的基因組剪切位點(diǎn)符合經(jīng)典的GT-AG規(guī)則。
　　3、通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了9條三葉斑潛蠅內(nèi)參基因片段，包括ACTIN，18S，TUB，AK，EF-1，CAD，RPL32，GAPDH和H3。利用qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)研究了三葉斑潛蠅9條內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性，運(yùn)用常用的內(nèi)參基因篩選程序(NormFinder、geNorm和BestKe

7、eper)以及比較ΔCt法對(duì)各內(nèi)參基因進(jìn)行了排名，最后使用RefFinder網(wǎng)頁(yè)程序進(jìn)行綜合評(píng)估，得出最佳的內(nèi)參基因方案。最合適的內(nèi)參基因組合如下:不同發(fā)育階段為ACTIN和18S;性別為TUB和18S;高溫脅迫為ACTIN和GAPDH;低溫脅迫為ACTIN和18S。最后，利用目的基因Lthsp21.7對(duì)篩選的內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明內(nèi)參基因的篩選對(duì)目的基因定量標(biāo)準(zhǔn)化研究非常必須。
　　4、采用qRT-PCR技術(shù)研究了三葉斑潛蠅

8、4條hsp70s在高低溫脅迫和不同發(fā)育階段條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明高低溫脅迫都能誘導(dǎo)Lthsp70s的表達(dá)，但表達(dá)情況各不相同。Lthsc70和Lthsp702對(duì)溫度脅迫不敏感其表達(dá)量最高時(shí)的溫度(Tmax)的表達(dá)倍數(shù)與對(duì)照組相比顯著比Lthsp701和Lthsp703低;4條hsp70s在三葉斑潛蠅各發(fā)育階段中均能表達(dá)，Lthsc70和Lthsp702在各發(fā)育階段中表達(dá)差異顯著，Lthsc70在雌成蟲(chóng)中的表達(dá)量最高，Lthsp702