兩株溶藻弧菌的分子鑒別【開題報(bào)告】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　兩株溶藻弧菌的分子鑒別</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p>　　弧菌在水生環(huán)境中分布非常廣泛，與真核生物（如魚、蝦、人等）有密切的關(guān)系。某些弧菌是重要的水產(chǎn)

2、養(yǎng)殖動(dòng)物的病原菌，有些還是人類的致病菌，嚴(yán)重的甚至致人死亡。然而，除了作為病原菌，弧菌在生態(tài)環(huán)境中也具有不可取代的作用?；【梢晕杖芙庥袡C(jī)物質(zhì)，從而對(duì)水環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)起作用；某些弧菌可以分解幾丁質(zhì)，增加了氨基糖的來源；還有的弧菌可以降解多元環(huán)芳香烴以及產(chǎn)抗生素等。</p><p>　　核糖體RNA（rRNA）分子存在于所有細(xì)胞生物中，rRNA基因與細(xì)菌整個(gè)基因組的變化相比，有高度的保守性。其本身的進(jìn)化就反映了

3、生物系統(tǒng)發(fā)育歷史，因此可以用來重現(xiàn)所有細(xì)胞生物間的進(jìn)化關(guān)系。另外，由于其在細(xì)菌染色體上存在多個(gè)拷貝，現(xiàn)已作為標(biāo)記基因廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分類學(xué)和細(xì)菌的分子流行病學(xué)研究中。16S rRNA基因序列包含10個(gè)可變區(qū)(variable region)和11個(gè)恒定區(qū)(constant region)，可變區(qū)因細(xì)菌而異，變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。迄今為止已有許多弧菌的的全序列16S rRNA基因得以破譯并免費(fèi)公布，十分方便進(jìn)行類似序列的比較分析

4、。隨著研究的深入，逐漸建立了以16S rRNA 基因?yàn)榉诸悩?biāo)準(zhǔn)的各大數(shù)據(jù)庫(kù)例如：GeneBenk、EMBL等。這些數(shù)據(jù)庫(kù)為廣大的分類及分子研究的科研院所以及學(xué)者提供了強(qiáng)大的數(shù)據(jù)支持。</p><p>　　然而，16S rRNA基因在弧菌的分類鑒定中卻存在一定的問題，我們可以借助于16S rRNA基因的測(cè)序及比對(duì)分析，將弧菌鑒定到屬乃至科的水平，但鑒定至種的水平就存在一定難度，因?yàn)樵诨【浦校?6S rRNA序列的

5、相似性高達(dá)97.6%以上，有些弧菌種之間的相似度甚至接近100％。因此，我們必須尋找新的用于鑒定的標(biāo)志分子來增強(qiáng)我們對(duì)于弧菌分類的認(rèn)識(shí)。隨著弧菌發(fā)現(xiàn)的種類的增加，以及分類學(xué)中新的問題的出現(xiàn)，新的分子鑒定基因不斷出現(xiàn)，用具有較高分辨率的分子基因如recA基因、gyr B基因、dna E基因、mdh基因和gap A基因等多種基因與16S rRNA基因相結(jié)合，共同分析鑒定，從而將其精確定位。</p><p>　　本研究

6、采用PCR方法同時(shí)進(jìn)行16S rRNA和另一種高分辨基因如（recA基因等)的分子鑒定，通過序列同源性分析顯示，確定該弧菌的分類學(xué)地位。該方法是一種十分方便有效的弧菌鑒定方法，可在實(shí)踐中加以推廣應(yīng)用。</p><p>　　此項(xiàng)課題為進(jìn)一步探究多基因分子鑒定在弧菌鑒定上發(fā)揮的作用和尋找防治致病弧菌的新方法提供理論依據(jù)。同時(shí)為研究弧菌群落演替提供技術(shù)支撐，為揭示弧菌的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)規(guī)律具有重要意義。</p&g

7、t;<p>　　相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定系統(tǒng)將會(huì)越來越完善，分子鑒定的精度也會(huì)越來越高，而且隨著人們對(duì)基因的進(jìn)一步深化了解和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定將會(huì)朝著系統(tǒng)化和高精度化發(fā)展，那些難以準(zhǔn)確定位的物種終將被準(zhǔn)確定位。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　?。ㄒ唬┭芯康幕緝?nèi)容：</p><p>　　本實(shí)

8、驗(yàn)主要是對(duì)采樣獲取的兩株弧菌中提取其總DNA，獲得該兩株菌的16S rRNA基因和另一種標(biāo)記分子，并進(jìn)行分子鑒定與序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建。</p><p>　　（二）擬解決的問題：</p><p>　　16S rRNA基因與其他高分辨基因(如recA基因等)相結(jié)合進(jìn)行對(duì)弧菌進(jìn)行鑒別和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p>

9、<p><b>　　（一）研究方法：</b></p><p><b>　　1、實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)材料為從環(huán)境樣品中提取出的兩株弧菌，進(jìn)行分離純化后接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)備用。</p><p>　　2、形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定</p><p>　　菌落大小、表面形態(tài)、邊

10、緣、質(zhì)地和光澤等特征進(jìn)行初步鑒別。</p><p><b>　　3、總DNA提取</b></p><p>　　大試管液體擴(kuò)繁，收集10ml培養(yǎng)液，離心；</p><p>　　加入2ml TE懸浮菌體，溶菌酶100 ul（50mg/ml）、Rnase A10ul(10mg/ml)，搖勻；水浴30min</p><p>　　

11、加入120ul 10%SDS和蛋白酶K(20mg/ml) 10ul 60℃水浴30min—1h</p><p>　　加入500ul 5mol/LNaCl，320ul CTAB/NaCl，65℃水浴10min</p><p>　　3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混勻）</p><p>　　轉(zhuǎn)移上清后用等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提1次</p

12、><p>　　加入1/10體積的(3mol/L)NaAC，0.6體積異丙醇沉淀DNA</p><p>　　用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗滌弄起DNA沉淀，混勻充分后洗滌。第三次重新洗滌，盡量減少DNA里面的鹽分和其他雜質(zhì)。</p><p>　　所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混勻。加

13、入0.6倍體積的異丙醇沉淀后重新70%酒精洗滌。風(fēng)干后，用25ul水溶解樣品。</p><p>　?、?風(fēng)干后，用50ul水溶解樣品，-20℃保藏。</p><p>　　4、PCR方法測(cè)定獲取目的基因序列</p><p>　　16Sr RNA基因PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)兩個(gè)引物。 在20tA反應(yīng)體系中含有：無(wú)菌蒸餾水14.4μL，1×PCR緩沖液2μL，1.5mm

14、ol/L MgCl2 1.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min、接94℃變性lmin、55℃復(fù)性1min和72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后72℃溫育6min。</p><p>　　5、隨機(jī)測(cè)序及序列分析</p><p>　　瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，預(yù)期大小

15、的擴(kuò)增條帶回收后克隆至pMD19-T載體，對(duì)序列進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定和分析采用ABI PRISMTM 3770 DNA自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序，由上海華大公司測(cè)定。序列分析采用BLAST分析軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)，多重序列比對(duì)采用DDBJ軟件ClustalW程序(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)，等電點(diǎn)分析采用ExPASy軟件(http://www.ex

16、pasy.ch/)，系統(tǒng)進(jìn)化分析由MEGA 4.0版程序完成(Tamura et al，2007)。</p><p>　　6、菌種分類位置確定</p><p>　　根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)基理化特性測(cè)定的結(jié)果，依據(jù)相關(guān)資料，并結(jié)合細(xì)菌發(fā)育學(xué)分析的結(jié)果，進(jìn)行分離菌的種屬分類位置判定。</p><p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線：</b></p&g

17、t;<p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.11畢業(yè)論文選題</p><p>　　2010.12進(jìn)行文獻(xiàn)查閱收集，完成開題報(bào)告及任務(wù)書，制定具體研究計(jì)劃和試驗(yàn)方案。</p><p>　　2011.01獲得兩株弧菌基因16S rRNA基因序列，對(duì)其進(jìn)行分析。</p><p>　　2011.02通過對(duì)兩

18、株弧菌的其他標(biāo)記分子進(jìn)行分子鑒別，確定其具體種類。</p><p>　　2011.03數(shù)據(jù)材料的整理和總結(jié)。</p><p>　　2011.03完成2篇外文翻譯，論文撰寫、提交并答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[ M].

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