源自太湖的兩株溶藻細(xì)菌及其溶藻機(jī)制的研究.pdf

1、近年來，淡水湖泊富營養(yǎng)化嚴(yán)重，藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重影響了淡水資源的有效利用，已經(jīng)成為一個全球性的問題。中國的第三大淡水湖太湖（面積：2338km2）也不例外。太湖不僅為流域的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了寶貴的淡水，而且是沿岸城鎮(zhèn)居民的重要飲用水水源。太湖流域位于長三角地帶，人口密集，是中國經(jīng)濟(jì)最發(fā)達(dá)的地區(qū)之一。近些年來，富含氮、磷的工農(nóng)業(yè)污水的排放引起了太湖水體嚴(yán)重的富營養(yǎng)化，進(jìn)而導(dǎo)致了以銅綠微囊藻為最優(yōu)勢藻種的太湖藍(lán)藻水華的頻繁和大規(guī)模爆發(fā)。藍(lán)

2、藻水華的頻繁爆發(fā)嚴(yán)重影響了太湖流域社會經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，也嚴(yán)重威脅到了流域居民的身體健康和飲用水安全。當(dāng)前，用于水華防控的物理和化學(xué)手段，由于費(fèi)用成本高，而且容易造成二次污染，因而它們的廣泛應(yīng)用受到了挑戰(zhàn)。藍(lán)藻水華的生物防控因其具有靶向性和環(huán)境友好性等優(yōu)點(diǎn)而被視為控制藍(lán)藻水華的很有發(fā)展?jié)摿Φ挠行侄?。尤其是，溶藻?xì)菌已被證實(shí)在水華消退過程中起著重要的作用，溶藻細(xì)菌在今后水華防控中將具有很好的應(yīng)用前景。
　　隨著藻菌互作研究的深入，

3、一些溶藻菌及其溶藻物質(zhì)已經(jīng)被分離和鑒定出來，并被證明是有效溶藻的。但是，對這些溶藻化合物在溶藻過程中的相互作用機(jī)制，以及溶藻細(xì)菌在溶藻化合物合成過程中的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。篩選更加高效的溶藻細(xì)菌、分離鑒定相應(yīng)溶藻物質(zhì)，并對溶藻化合物在溶藻過程中的相互作用機(jī)制，以及溶藻細(xì)菌在溶藻化合物合成過程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入的研究，有助于設(shè)計新的、有效的防控藍(lán)藻藻華的策略。
　　本研究從太湖嚴(yán)重富營養(yǎng)化的梅梁灣水域的藍(lán)藻水華中，分離出了17株對

4、源自太湖水華的銅綠微囊藻9110具有較好溶藻效果的溶藻細(xì)菌。經(jīng)16S rRNA測序鑒定，這17株溶藻細(xì)菌主要集中在金黃桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、叢毛單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、微小桿菌屬。它們多數(shù)為革蘭氏陰性細(xì)菌。
　　金黃桿菌GLY-1106對銅綠微囊藻9110具有最強(qiáng)的溶藻活性（六天溶藻率達(dá)98.8%）。研究發(fā)現(xiàn)，該菌不僅對微囊藻具有強(qiáng)的溶藻活性，而且對顫藻、綠藻、衣藻等其它藻也具有較好的溶藻效果（六天的溶藻率高

5、于90%），說明金黃桿菌GLY-1106溶藻譜較廣。金黃桿菌GLY-1106的溶藻模式是間接的，主要通過分泌胞外熱穩(wěn)定的溶藻活性物質(zhì)進(jìn)行溶藻。采用乙酸乙酯萃取，硅膠柱色譜、高效液相色譜等技術(shù)從金黃桿菌GLY-1106發(fā)酵液中分離、純化出了兩個對銅綠微囊藻具有溶藻活性的物質(zhì)，并綜合應(yīng)用超高效液相色譜高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜電子轟擊離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振技術(shù)等解析了溶藻物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。金黃桿菌GLY-1106的兩個溶藻

6、物質(zhì)分別是：7-羥基-3-異丁基-六氫-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（簡稱：環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)，cyclo(4-OH-Pro-Leu)）和六氫-3-(2-甲基丙基)-吡咯[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（簡稱：環(huán)(脯氨酸-亮氨酸)，cyclo(Pro-Leu)）。cyclo(4-OH-Pro-Leu) 和cyclo(Pro-Leu)對銅綠微囊藻9110的半數(shù)有效濃度分別為1.26和2.70μg ml-1。<

7、br>　　通過組合實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，金黃桿菌 GLY-1106所分泌的cyclo(4-OH-Pro-Leu)與cyclo(Pro-Leu)之間存在協(xié)同溶藻效應(yīng)。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，cyclo(4-OH-Pro-Leu)主要破壞藍(lán)藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)，中斷藍(lán)藻光合系統(tǒng)中光合電子的傳遞；cyclo(Pro-Leu)主要抑制藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性。進(jìn)一步在細(xì)胞水平從氧化還原穩(wěn)態(tài)的角度解析了兩種溶藻物質(zhì)之間的協(xié)同機(jī)制：兩種溶藻物質(zhì)的組合使用使藍(lán)藻細(xì)胞的光合能力和

8、抗氧化酶活性同時被抑制，加速了氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的更快上升和氧化損傷（如：脂質(zhì)過氧化）（實(shí)驗結(jié)果也顯示了這個變化）；另外，較高的活性氧水平可能進(jìn)一步加速了抗氧化酶活性和光合能力的下降，進(jìn)而導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的更大幅度上升以及更大程度的氧化損傷（實(shí)驗結(jié)果也顯示了這個變化），最終導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)胞死亡、裂解。
　　群體感應(yīng)是一種細(xì)胞濃度依賴的細(xì)菌細(xì)胞之間的信息交流機(jī)制，對細(xì)菌許多的代謝功能和行為起著重要的調(diào)控作

9、用。革蘭氏陰性細(xì)菌中最常見的群體感應(yīng)信號分子為氮?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）。前期研究顯示，群體感應(yīng)系統(tǒng)可能在溶藻細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成溶藻物質(zhì)的過程中起著一定的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步確證群體感應(yīng)系統(tǒng)在溶藻細(xì)菌合成溶藻物質(zhì)過程中的可能調(diào)控作用及相應(yīng)調(diào)控機(jī)制，本研究采用AHL的生物傳感器菌株紫色色桿菌CV026從17株溶藻細(xì)菌中篩選產(chǎn)AHL的菌株。研究發(fā)現(xiàn)具有最高溶藻活性的金黃桿菌GLY-1106不產(chǎn)生可檢測的AHL。產(chǎn)生AHL的溶藻菌株主要集中在氣

10、單胞菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、鞘氨醇桿菌屬。氣單胞菌GLY-2107在產(chǎn)AHL的溶藻菌株中具有最高的溶藻活性，因此對其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌 GLY-2107具有較寬的溶藻譜，該菌不僅對微囊藻具有強(qiáng)的溶藻活性，而且對顫藻、綠藻、衣藻等其它藻也具有較好的溶藻效果（六天的溶藻率高于90%）。氣單胞菌GLY-2107的溶藻模式是間接的，主要通過分泌胞外熱穩(wěn)定的溶藻活性物質(zhì)進(jìn)行溶藻。采用乙酸乙酯萃取，硅膠柱色譜和

11、高效液相色譜等技術(shù)從氣單胞菌 GLY-2107發(fā)酵液中分離、純化出了兩個對銅綠微囊藻具有溶藻活性的物質(zhì)，并綜合應(yīng)用超高效液相色譜高分辨電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜電子轟擊離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振技術(shù)等解析了溶藻物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。氣單胞菌 GLY-2107的兩個溶藻物質(zhì)分別是：3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮（簡稱：環(huán)(甘氨酸-苯丙氨酸)，cyclo(Gly-Phe)）和3-甲基吲哚。3-甲基吲哚和cyclo(Gly-Phe)對銅綠

12、微囊藻9110的半數(shù)有效濃度分別為1.10和4.72μg ml-1。
　　綜合應(yīng)用反相薄層層析-AHL生物傳感器菌株檢測技術(shù)、高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了氣單胞菌GLY-2107的AHL指紋。氣單胞菌GLY-2107產(chǎn)兩種AHL，分別為丁酰高絲氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）和己酰高絲氨酸內(nèi)酯（C6-HSL）。通過對AHL合成酶基因及相應(yīng)的受體基因敲除、并對AHL合成酶缺陷菌株進(jìn)行化學(xué)回補(bǔ)、及對AHL受體基因缺陷菌株進(jìn)