太湖溶藻菌強化除藻作用與機制的研究.pdf

1、課題組從位于太湖梅梁灣水域的試驗基地分離篩選出具有顯著生物降解藻細胞和MC-LR作用的4株不同種屬的高效土著溶藻菌。在進行溶藻菌的微生物學(xué)種屬鑒定、生物除藻作用、現(xiàn)場中試研究的基礎(chǔ)上，著重探討了溶藻菌除藻作用的機制：借助課題組新合成的納米人工載體，采用微生物固定化技術(shù)，探討了固定化溶藻菌的強化除藻作用，以期發(fā)展一種新型的生物除藻技術(shù)，應(yīng)用于富營養(yǎng)化水體除藻工程中；同時以模式生物秀麗線蟲作為試驗對象，研究了在低作用劑量下，MC-LR對線蟲

2、的壽命、行為、生長發(fā)育和生殖機能等毒性作用和神經(jīng)毒作用機制，以及MC－LR溶藻菌生物降解產(chǎn)物的毒性作用。 一、高效太湖溶藻菌的鑒定和除藻作用評價 自太湖試驗基地除藻中試裝置的組合介質(zhì)中，分離獲得了24h溶藻率達40％以上的土著溶藻菌20株，經(jīng)分析，其優(yōu)勢土著溶藻菌為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和弧菌屬。從中選取4株代表性的高效太湖土著溶藻菌，采用傳統(tǒng)細菌分類學(xué)（形態(tài)學(xué)、APIID32GN細菌鑒定系統(tǒng)）、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技

3、術(shù)對其進行種屬鑒定。初步確定該4株溶藻菌分別為副溶血弧菌、萎縮芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、斑點氣單胞菌。 4株高效土著溶藻菌均表現(xiàn)出較強生物降解藻細胞和MC-LR作用的能力。在起始濃度為106/mL時，對濃度為5．57×107個/ml銅綠微囊藻作用72h后的溶藻率均達到100％，對起始濃度為12．4mg/L胞外MC-LR作用72h的降解率分別為71．8％、68．9％、73．7％和80．6％，而對胞內(nèi)MC-LR的降解率低于同期對胞外M

4、C-LR的降解率。以MC-LR濃度的對數(shù)值和作用時間的曲線進行線性擬合分析，結(jié)果顯示該4株溶藻菌對MC-LR的降解反應(yīng)基本符合動力學(xué)一級降解反應(yīng)。對影響4株溶藻菌生物降解作用的因素進行分析，MC-LR與溶藻菌的濃度之比、溶藻菌的生物學(xué)特性（金屬離子等）等均可影響溶藻菌對MC-LR的降解作用。 中試試驗結(jié)果顯示，溶藻菌同樣表現(xiàn)出較好的生物降解藻細胞和MC-LR作用。其中菌培養(yǎng)液和胞外液在作用96h后，水體中葉綠素α含量分別下降了4

5、1．8％和28．3％，MC-LR濃度分別下降了43．2％和20．5％，CODMn含量分別下降了33．6％和25．6％。 二、太湖溶藻菌除藻機制的研究 通過對斑點氣單胞溶藻菌的不同處理組分進行溶解銅綠微囊藻細胞和降解MC-LR作用的試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，相比于胞外活性物質(zhì)，無論是細菌菌體，還是細菌內(nèi)物質(zhì)，對銅綠微囊藻細胞的溶解率和MC-LR的降解率都遠低于胞外物質(zhì)，由此說明，斑點氣單胞溶藻菌主要是通過分泌胞外活性物質(zhì)的方式發(fā)揮

6、生物降解藻細胞和MC-LR作用的。 對經(jīng)不同條件和方式處理后的溶藻菌胞外活性成分進行生物降解藻細胞和MC-LR作用試驗，結(jié)果表明，在pH5-9的范圍內(nèi)，胞外活性成分的溶藻作用在弱酸性條件下會受到抑制，而弱堿條件有助于增強其溶藻作用；胞外活性成分對溫度相對穩(wěn)定，在30℃-121℃范圍內(nèi)，且隨著溫度的升高，其溶藻率也逐步增加，說明高溫可能有助于提高活性成分的溶藻能力；經(jīng)石油醚、氯仿和乙酸乙酯等不同極性的溶劑萃取后，水相組48h的溶藻

7、率分別為72．5％、62．2％和49．1％，MC-LR降解率分別為54．4％、48．5％和36．7％，由此說明，溶藻菌胞外物質(zhì)經(jīng)不同極性溶劑的萃取后，含量存在較大差異，隨著溶劑極性的降低（極性：石油醚<氯仿<乙酸乙酯），水相中萃取到的活性成分的含量越高，顯示出活性成分具有較強的親水性。同時，溶藻菌胞外活性成分在醇析沉淀物中的含量較高，在抽提液中的含量較低；對胞外濾液進行蛋白質(zhì)的定性和定量測定，均未檢出蛋白質(zhì)的存在。由此推測，斑點氣單胞溶

8、藻菌分泌的具有生物降解藻細胞和MC-LR作用的胞外活性物質(zhì)很可能是一類具有較好的熱穩(wěn)定性、親水性的小分子物質(zhì)。 三、固定化溶藻菌的強化除藻作用 以課題組制備的2種新型的納米材料氧化鐵納米顆粒和聚己內(nèi)酯納米纖維膜作為載體介質(zhì)：其中Fe2O3納米顆粒采用共沉淀法制備獲得，從其表征可知，F(xiàn)e2O3納米粒子呈球形，分布均勻，平均直徑約為37nm；聚己內(nèi)酯納米纖維膜（NMP）材料，采用的納米級高分子纖維膜是由親水性聚酯納米纖維或者

9、含有添加劑的親水性聚酯納米纖維無規(guī)堆砌而成，纖維直徑為100nm-5000nm。 氧化鐵納米顆粒和聚己內(nèi)酯納米纖維膜均具有很好的固定化溶藻菌的功效：劑量為0．40mg/mL的氧化鐵納米顆粒對濃度為104個/mL，溶藻菌3h的固定化率達到38．0％，遠高于普通Fe2O3（P<0．05），而且在反應(yīng)3h后就達到了飽和。通過粒徑大小及粒徑分布測定，發(fā)現(xiàn)氧化鐵納米顆粒與細菌混合后的顆粒物的平均直徑增加到氧化鐵納米顆粒的12．3倍，同時氧

10、化鐵納米顆粒和細菌單獨存在時的粒徑分布峰消失。聚己內(nèi)酯納米纖維膜30h固定化溶藻菌的濃度約為3．39×107/ml，每平方厘米固定化溶藻菌的數(shù)量約為5．65×107個，其固定化率約在30h達到高峰。 2種介質(zhì)載體固定化溶藻菌表現(xiàn)出了較好的生物降解藻細胞和MC-LR作用：其中氧化鐵納米顆粒固定化芽孢桿菌作用24h后，對銅綠微囊藻的溶藻率達到53．0％，MC-LR的降解率達到33．0％，分別是對照組的1．2倍和1．6倍。聚己內(nèi)酯納米

11、纖維膜固定化假單胞溶藻菌、斑點氣單胞溶藻菌對藻細胞48h的降解率分別為85．7％和87．2％，對MC-LR48h降解率分別達到60．16％和70．94％，效果優(yōu)于市場上2種成熟的商品化介質(zhì)材料。聚己內(nèi)酯納米纖維膜可重復(fù)利用的次數(shù)為4次，添加葡萄糖、蛋白胨等溶藻菌營養(yǎng)物質(zhì)后，有助于提高固定化溶藻菌的生物降解藻細胞和MC-LR作用。 四、應(yīng)用秀麗線蟲評價MC-LR及其降解產(chǎn)物的生物毒性作用 本研究探討了秀麗線蟲（C．eleg

12、ans）在MC-LR毒性作用評價中的可行性和評價指標(biāo)的敏感性。試驗結(jié)果顯示，在40-80μg/L的濃度范圍內(nèi)，MC-LR能夠縮短C．elegans的壽命、延緩發(fā)育；在10μg/L染毒劑量時，MC-LR能夠?qū)е翪．elegans的世代生殖時間和行為運動能力的改變；而在1μg/L染毒劑量時，線蟲的產(chǎn)卵量仍顯著下降。此外，神經(jīng)、肌肉、消化、生殖系統(tǒng)中hsp-16-2-gfp的表達率升高，表明其對MC-LR的應(yīng)激反應(yīng)率增強，可作為MC-LR導(dǎo)致

13、C．elegans氧化應(yīng)激作用的早期標(biāo)志。因此，C．elegans是一種可用于MC-LR毒性評價的有價值的指示動物，C．elegans的產(chǎn)卵量和hsp-16-2-grg表達率是評價MC-LR毒性的敏感指標(biāo)，而神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)可能較早受到MC-LR的影響。 研究表明，C．elegans的神經(jīng)系統(tǒng)也是較早受到MC-LR影響的器官和系統(tǒng)之一。MC-LR可導(dǎo)致C．elegans對氯化鈉和丁二酮的化學(xué)趨向性和溫度趨向性的嚴重缺陷，這種神

14、經(jīng)毒性主要是由相應(yīng)的感覺神經(jīng)元（如ASE、AWA、和AFD）和中間神經(jīng)元AIY的功能及其分子水平的損傷所致。與野生型線蟲N2相比，che-1（p674）、odr-7（ky4）、ttx-1（p767）、ttx-3（ks5）等多種線蟲突變體對氯化鈉和丁二酮的化學(xué)趨向性和溫度趨向性有顯著的下降。在10μg/L染毒劑量時，C．elegans的che-1和odr-7基因的表達水平顯著下降（P<0．05），而ttK-1和ttx-3基因的表達水平在1