Walker256大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移性癌痛模型的建立及伊班膦酸鈉作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，乳腺癌易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而骨骼又是乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的常見(jiàn)部位。骨痛、骨損傷、骨相關(guān)事件（SREs）及生活質(zhì)量降低是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。
　　 骨癌痛是最嚴(yán)重的一種癌痛，主要源于原發(fā)性骨腫瘤或肺癌、乳腺癌、前列腺癌等繼發(fā)骨轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響癌癥患者的生活質(zhì)量。在1999年Schwei等首次報(bào)道小鼠骨癌痛模型之前，癌痛研究一直是在非癌癥引起的慢性疼痛模型上進(jìn)行的。實(shí)際上，

2、兩者的發(fā)病機(jī)制并不相同，而在神經(jīng)病理性疼痛治療中有效的藥物也不能緩解癌痛。近年來(lái)，運(yùn)用局部注射方法將不同的腫瘤細(xì)胞接種至脛骨骨髓腔內(nèi)，成功建立了脛骨癌痛模型，該模型可視為轉(zhuǎn)移性骨癌痛模型，為揭示癌痛的機(jī)制及臨床防治提供了有效的研究手段。
　　 目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠X線、CT、ECT等影像學(xué)手段，診斷率低。骨鈣素（BGP）是由成骨細(xì)胞合成、釋放的一種維生素K依賴(lài)蛋白。文獻(xiàn)報(bào)道，惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移時(shí)血清BGP會(huì)發(fā)生一定的變化，

3、血清BGP對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的診斷有一定參考價(jià)值。
　　 有資料報(bào)道，腫瘤所致的骨質(zhì)破壞活動(dòng)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子（例如ET-1，PGE2），他們?cè)趯?dǎo)致骨溶解的同時(shí)，也致敏周?chē)窠?jīng)末梢，因而增加了機(jī)體對(duì)痛覺(jué)刺激的敏感性。伊班膦酸鈉屬于第三代雙膦酸鹽類(lèi)藥物，該藥可顯著減少乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的骨相關(guān)事件，明顯緩解骨痛，改善生活質(zhì)量。
　　 因此，我們運(yùn)用Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞來(lái)制備脛骨癌痛模型，在該模型的基礎(chǔ)上研究疼痛行為學(xué)

4、變化，骨質(zhì)病理組織學(xué)改變；在大鼠脛骨癌痛模型的基礎(chǔ)之上，測(cè)定血清BGP水平，探查血清BGP在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的診斷價(jià)值，以實(shí)現(xiàn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的早期診斷；應(yīng)用該模型觀察伊班膦酸鈉的抗骨癌痛作用，并觀察細(xì)胞因子內(nèi)皮素-1（ET-1）、前列腺素E2（PGE2）在骨癌痛形成過(guò)程中及治療后的變化，從而探討骨癌痛的形成以及雙膦酸鹽發(fā)揮作用可能的分子機(jī)制，并且為今后骨癌痛分子靶向藥物的研制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 將60只Wista

5、r大鼠（160-180g）隨機(jī)分成PBS組、觀察組、治療組3組，每組20只。對(duì)于觀察組、治療組大鼠應(yīng)用微量進(jìn)樣器向Wistar大鼠左側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)接種walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞，4ul/只（含4*104個(gè)大鼠乳腺癌細(xì)胞）構(gòu)建大鼠脛骨癌痛模型；對(duì)于PBS組大鼠應(yīng)用微量進(jìn)樣器向Wistar大鼠左側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)接種同等體積的無(wú)菌PBS溶液。治療組大鼠于造模后（post implantation day，PID）8天開(kāi)始，皮下注射伊班膦酸

6、鈉4ug/只1/日，連用10天；PBS組和觀察組皮下注射等體積的生理鹽水，1/日，連用10天。分別于PID0，6，8，11，14，17進(jìn)行一般狀況觀察，以及大鼠自由行走痛行為評(píng)分和丙酮刺激引發(fā)縮足反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定；并于PID17應(yīng)用放射免疫法進(jìn)行大鼠血清BGP，血漿ET-1，PGE2測(cè)定及大鼠左側(cè)脛骨HE染色。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠一般狀況<

7、br>　　 在整個(gè)觀察期內(nèi)，無(wú)一例大鼠死亡。各組大鼠造模前后，在精神狀態(tài)、進(jìn)食水、體重方面均無(wú)顯著差異。體重在觀察期內(nèi)均緩慢增加。
　　 2.大鼠疼痛行為學(xué)變化
　　 2.1自由行走痛行為學(xué)評(píng)分
　　 PBS組在造模后評(píng)分有所升高，最高達(dá)1分，但于PID6開(kāi)始逐漸下降恢復(fù)正常；觀察組、治療組大鼠造模后評(píng)分亦升高，但較PBS組升高明顯，最高達(dá)4分，于PID6與PBS組相比有顯著差異（F=12.83，P<0.01）

8、；治療組大鼠于PID14（給藥第7天）內(nèi)評(píng)分與觀察組并無(wú)明顯差異，于PID14，PID17與觀察組相比評(píng)分顯著下降，但仍明顯高于PBS組。
　　 2.2縮足反應(yīng)時(shí)間
　　 兩組造模動(dòng)物于PID8縮足反應(yīng)時(shí)間明顯下降（P<0.01），與PBS組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組大鼠于PID14（給藥第7天）縮足反應(yīng)時(shí)間較觀察組明顯延長(zhǎng)（P<0.05），但仍短于PBS組；于PID17，與PBS組無(wú)明顯差異（P>0.05）。

9、　　 2.3骨組織病理學(xué)改變（HE染色）
　　 PBS組：骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)各種正常的骨髓細(xì)胞，未見(jiàn)骨結(jié)構(gòu)改變。觀察組：骨髓腔內(nèi)幾乎被核大深染的腫瘤細(xì)胞所填充，大部分呈活躍狀態(tài)，部分腫瘤細(xì)胞己壞死，骨小梁稀少。治療組：骨髓腔內(nèi)可見(jiàn)少量生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞，大部分腫瘤細(xì)胞已壞死，骨小梁破壞明顯。
　　 2.4各組大鼠血清骨鈣素（BGP）含量的比較
　　 與PBS組相比，觀察組大鼠血清中BGP含量明顯升高（P<0.01），

10、有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組大鼠血清BGP含量較觀察組顯著下降（P<0.05），但仍顯著高于PBS組（P<0.05）。
　　 2.5各組大鼠血漿內(nèi)皮素-1（ET-1）含量的比較
　　 與PBS組相比，觀察組大鼠血漿中ET-1含量明顯升高（P<0.01，），有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組大鼠血漿ET-1含量較觀察組顯著下降（P<0.01），與PBS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.6各組大鼠血漿前列腺素E2（PGE2）含量的比

11、較
　　 與PBS組相比，觀察組大鼠血漿中PGE2含量明顯升高（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療組大鼠血漿PGE2含量較觀察組顯著下降（P<0.01），與PBS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功構(gòu)建了一個(gè)與人類(lèi)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移所致骨癌痛相似的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究骨癌痛的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 2.血清BGP對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷有一定的臨床參考價(jià)值。
　　 3.骨癌痛的產(chǎn)生與ET