MicroRNA-221及EphA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251中關(guān)于生長、凋亡等方面作用的研究.pdf

1、目的： 探索microRNA-221及EphA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251中的表達情況及研究兩者在U251細胞增殖、凋亡等方面所起的作用。尋找診斷膠質(zhì)瘤及潛在應(yīng)用于膠質(zhì)瘤基因治療的新方法。 方法： 第一部分： 1、通過查閱文獻得知，microRNA-221(miRNA-221)在多個神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本及多種膠質(zhì)瘤細胞系中的表達顯著高于正常腦組織標本。由此推斷miRNA-221在膠質(zhì)瘤形成過程中可能是癌基因。

2、 2、體外化學合成針對miRNA-221的2’-甲氧修飾的反義寡核苷酸單鏈和非特異性陰性對照單鏈miRNA。 3、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將合成的miRNA-221的反義鏈轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細胞系中，用CCK-8及AnnexinV/PI試劑盒檢測細胞的增殖和凋亡情況。 第二部分： 1、RT-PCR檢測U251細胞和U87細胞系及正常腦組織標本中EphA2基因的表達情況； 2、體外合成靶向EphA2基因

3、的特異性siRNA和非特異性陰性對照siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將siRNA導(dǎo)入膠質(zhì)瘤U251細胞系中，并用Real-timePCR和Western blot方法檢測siRNA-EphA2對U251細胞中EphA2表達的影響； 3、觀察特異性siRNA轉(zhuǎn)入U251細胞后是否引起膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的降低及是否可以誘導(dǎo)細胞凋亡。以此來研究EphA2基因在膠質(zhì)瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用。 結(jié)果： 第一

4、部分：用脂質(zhì)體方法把miRNA-221的反義鏈轉(zhuǎn)染入U251細胞后。 1、用CCK-8檢測到實驗組膠質(zhì)瘤細胞的生長速度與陰性對照組相比受到了明顯的抑制。 2、流式細胞儀檢測到轉(zhuǎn)染對照組miRNA細胞的凋亡率為3.07％，轉(zhuǎn)染miRNA-221反義序列組的細胞凋亡率為4.12％，三次重復(fù)實驗均表明兩組之間細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異。 第二部分： 1、通過基因水平檢測，EphA2基因在膠質(zhì)瘤U251和U87細胞中

5、的表達水平明顯高于正常腦組織； 2、用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染siRNA-EphA2后U251細胞中EphA2蛋白表達量，轉(zhuǎn)染10 nM時，蛋白的抑制率與陰性對照組相比達到50％，50 nM時蛋白的抑制率為70％；用Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染10 nM、50 nM siRNA-EphA2后EphA2 mRNA的表達水平與陰性對照組相比分別降低了45％、70％； 3、流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞的凋

6、亡率為6.56％，轉(zhuǎn)染siRNA-EphA2組的凋亡率為28.21％，凋亡率的差別有顯著的統(tǒng)計學意義； 4、以50 nM濃度轉(zhuǎn)染U251細胞，實驗組細胞的生長速度及遷移、侵襲能力較陰性對照組明顯下降。 結(jié)論： 1、MiRNA-221在膠質(zhì)瘤細胞U251中，可以促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。但在抑制腫瘤細胞凋亡方面沒有顯著的作用。 2、EphA2基因在正常腦組織標本中的表達明顯低于兩種膠質(zhì)瘤細胞系。 3、應(yīng)