高低不同轉(zhuǎn)移特性MCF7細(xì)胞亞株的篩選及基因表達(dá)的差異分析.pdf

1、目的:篩選高低不同轉(zhuǎn)移特性并穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的人乳腺癌MCF7細(xì)胞亞株，檢測細(xì)胞亞株之間基因表達(dá)的差異，以篩選乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。 方法:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染GFP入人乳腺癌MCF7細(xì)胞，通過有限稀釋法、細(xì)胞電泳，獲得高低不同轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞亞株，測定細(xì)胞亞株的增殖率，通過組織形態(tài)學(xué)觀察、軟瓊脂克隆形成率、transwell小室體外侵襲能力測定、裸鼠體內(nèi)成瘤試驗等研究細(xì)胞亞株的生物學(xué)特性；將C6作為實驗組，A2為對照組，用cDNA

2、微陣列的方法比較兩個細(xì)胞亞株之間基因表達(dá)的差異；用實時定量PCR法檢測、驗證cDNA微陣列中顯著差異表達(dá)的整合素aV基因和微陣列中宋涉及的整合素a4基因。 結(jié)果:獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白不同轉(zhuǎn)移特性的兩個細(xì)胞亞株A2(高轉(zhuǎn)移特性)和C6(低轉(zhuǎn)移特性)，其中A2的群體倍增時間為25.6h，軟瓊脂形成率為30.7％；C6群體倍增時間為41.8h，軟瓊脂形成率為14％；transwell小室體外侵襲能力測定發(fā)現(xiàn)，A2細(xì)胞亞株的平均侵襲

3、細(xì)胞數(shù)為136.80±12.36個，明顯高于C6的平均侵襲細(xì)胞數(shù)73.62±9.76個；裸小鼠皮下成瘤試驗發(fā)現(xiàn)A2成瘤時間短，瘤體直徑大，細(xì)胞增殖快。A2、C6細(xì)胞亞株的基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個細(xì)胞亞株之間發(fā)生顯著性表達(dá)變化的基因有767個，其中與A2相比，在C6中上調(diào)表達(dá)的基因有480個，下調(diào)表達(dá)的基因有287個。在發(fā)生明顯表達(dá)變化的基因中具有比較明顯的功能類別特征的包括與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因、與細(xì)胞生長及增殖調(diào)控相關(guān)的基因、以及與細(xì)

4、胞氧化張力應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因，提示與A2細(xì)胞相比，C6細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化以及應(yīng)激反應(yīng)活化等特征。實時定量PCR檢測A2、C6細(xì)胞亞株的ITGA-V基因發(fā)現(xiàn)，A2細(xì)胞亞株樣本的ITGA-V基因平均拷貝數(shù)為6574.56，C6細(xì)胞亞株ITGA-V基因的平均拷貝數(shù)為318.84，A2細(xì)胞亞株ITGA-V基因的拷貝數(shù)大于C6細(xì)胞亞株的ITGA-V基因的拷貝數(shù)；實時定量PCR檢測A2、C6細(xì)胞亞株的ITGA4基因發(fā)現(xiàn)，A2細(xì)胞亞

5、株樣本的ITGA4基因平均拷貝數(shù)為19.98，C6細(xì)胞亞株的平均拷貝數(shù)為49.26，A2細(xì)胞亞株ITGA4基因的拷貝數(shù)小于C6細(xì)胞亞株ITGA-V基因的拷貝數(shù)。 結(jié)論:篩選出的兩個細(xì)胞亞株有不同的轉(zhuǎn)移特性，GFP的整合及表達(dá)未對MCF7細(xì)胞的生長狀態(tài)、生物學(xué)性狀未造成明顯影響，可作為報告基因進(jìn)一步研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機制和治療；cDNA微陣列法對于篩選乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有獨特的優(yōu)勢，獲得的差異表達(dá)基因具有較強的代表性，為尋找乳腺