不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)譜的差異分析.pdf

1、基因芯片又稱DNA芯片，是最先研究也是較為成熟的一種生物芯片，以高通量、高靈敏度、并行檢測為特點(diǎn)，在大腸癌及其它惡性腫瘤中應(yīng)用廣泛。通過基因芯片構(gòu)建腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜，研究腫瘤相關(guān)基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的功能，揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的規(guī)律，為腫瘤病原、病因、病理學(xué)研究，各種腫瘤的臨床診斷、治療藥物篩選、預(yù)后判斷、治療效果監(jiān)測甚至腫瘤預(yù)防等領(lǐng)域的研究開辟了廣闊的前景。本文主要對基因芯片技術(shù)在大腸癌轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜

2、述。 結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前大腸癌的治療手段和患者的預(yù)后雖然有了較大的改善，但術(shù)后局部復(fù)發(fā)與繼發(fā)的的淋巴道轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移仍是嚴(yán)重威脅患者生命的主要因素[1-2]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的、腫瘤細(xì)胞與宿主相互作用的過程。在其轉(zhuǎn)移的每一步都涉及多個(gè)分子的相互作用以及不同基因在DNA或RNA水平上的一過性或永久性變化。因此，對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行克隆和功能分析，不僅有利于闡述大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，而且還有望為臨床診

3、治、藥物篩選和預(yù)后判斷尋找新的靶點(diǎn)?；蛐酒某霈F(xiàn)，克服了傳統(tǒng)的基因檢測方法(如Southernblot，Northernblot和RT-PCR)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力及針對基因數(shù)目少等諸多缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對靶基因信息的快速、自動(dòng)化、批量化的檢測，獲得不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性并通過生物信息學(xué)方法對表達(dá)譜檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，從整體空間上把握與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因及其表達(dá)、調(diào)控模式，推測和分析其生物學(xué)功能，篩選出腫瘤診斷、預(yù)后的分子標(biāo)志物及治療的靶基

4、因，具有大規(guī)模、高效率的特點(diǎn)。本文主要對基因芯片技術(shù)在大腸癌轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。 1基因芯片概述 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜、多步驟的、腫瘤細(xì)胞與宿主之間相互作用的過程，它涉及到原發(fā)腫瘤組織上異質(zhì)細(xì)胞亞群的選擇，腫瘤細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)性、抵御機(jī)體免疫殺傷、血管生成等多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程中，腫瘤細(xì)胞的基因調(diào)控發(fā)揮著主導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果是轉(zhuǎn)移表型的出現(xiàn)和細(xì)胞形態(tài)的變化。深入對腫瘤轉(zhuǎn)移

5、異質(zhì)性的機(jī)制研究，確定腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能及其相關(guān)因素對判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療、提高患者生活質(zhì)量具有十分重要的意義。 相同遺傳背景、不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系可以排除和減低相關(guān)的實(shí)驗(yàn)干擾，通過比較細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)特性、表達(dá)基因及蛋白差異等，可以確定腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白，成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究不可多得的理想模型。 本課題選擇具有相同遺傳背景的3個(gè)大腸癌細(xì)胞系(SW620、SW480和SW480/liver)作為研究對象，我們前期的裸鼠原位移植

6、實(shí)驗(yàn)己證實(shí)，3個(gè)細(xì)胞系分別具有不同轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，SW620細(xì)胞具有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的選擇性，而SW480細(xì)胞的異質(zhì)性較強(qiáng)，易形成廣泛的淋巴道、血道轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移，SW480/liver是本實(shí)驗(yàn)室是從SW480細(xì)胞系中篩選獲得的具有高選擇肝轉(zhuǎn)移潛能的亞系。我們以SW480為參照母系，通過比較SW620、SW480/liver兩者之間形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)譜的差異，探討它們在大腸癌轉(zhuǎn)移中作用及其相互關(guān)系。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 一、

7、不同轉(zhuǎn)移潛能不同的大腸癌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異分析 不同轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞存在膜表面分子種類和數(shù)量等的差異，其超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)也必然存在或多或少的差異，為了解腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)移潛能是否存在相關(guān)性，我們在對3株大腸癌細(xì)胞系進(jìn)行形態(tài)和表面超微結(jié)構(gòu)觀測的同時(shí)，應(yīng)用免疫組化檢測了Fascin、PCNA、CEA、CD44等的表達(dá)。由于腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)黏附可影響細(xì)胞的形態(tài)，我們采用多聚賴氨酸包被的玻片和無任何處理載波片作為培養(yǎng)細(xì)胞的附著物，使黏附

8、對細(xì)胞的形態(tài)影響減低到最小程度。 二、不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞基因表達(dá)譜檢測及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選 基因芯片技術(shù)是功能性基因研究的重要手段，能夠高通量、高效率、低消耗地對生物學(xué)信息進(jìn)行快速分析處理，大規(guī)模的獲取相關(guān)生物信息，篩選癌癥發(fā)生、發(fā)展可能的相關(guān)基因，使研究能夠在基因組水平上以系統(tǒng)的、全局的觀念去研究分析腫瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制。 基于Affymetrix芯片的可靠性，采用HG-U133Plus2.0原位合成寡核苷酸

9、芯片對SW620、SW480和SW480/liver細(xì)胞3個(gè)樣品的基因表達(dá)譜進(jìn)行了檢測，以求從整體基因水平研究大腸癌轉(zhuǎn)移器官趨向性的作用機(jī)制。 三、大腸癌細(xì)胞基因表達(dá)譜生物信息學(xué)分析 大腸癌轉(zhuǎn)移部位主要是淋巴結(jié)和肝臟，這種親器官的轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全明了，也是目前研究的熱點(diǎn)。通過對篩選的差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析，從基因表達(dá)譜輪廓探討不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞基因表達(dá)特點(diǎn)以及篩查大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，為大腸癌的診斷、預(yù)后提供分子

10、生物學(xué)指標(biāo)，并初步從整體基因網(wǎng)絡(luò)水平探討大腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制。 生物功能分析采用GOTM(GeneOntologyTreeMachine)在線軟件進(jìn)行，GOTM它的特點(diǎn)是可以通過對上傳的基因和表達(dá)信號值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，指出顯著相關(guān)富集基因群的GO分類域點(diǎn)，以提醒研究者進(jìn)一步分析。 通過對篩查出的基因群生物功能分析，在兩組共同表現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的基因群主要涉及細(xì)胞代謝、細(xì)胞生理進(jìn)程調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)、大分子代謝、基本代謝和代謝調(diào)節(jié)等

11、，有一部分基因生物過程功能未知(ABCC4、KLF6、HOXA9、HSPCA、IFI27、KRT10、TM4SF1、SDC4)，由于這部分基因在兩組中存在共性表達(dá)，是否與轉(zhuǎn)移有關(guān)，還需進(jìn)一步研究明確。 為進(jìn)一步了解基因在細(xì)胞內(nèi)的功能和代謝結(jié)構(gòu)，我們把篩選出的SW620差異表達(dá)2555的基因&EST上傳至PathwayExplorer，分析了解篩選基因在信號傳導(dǎo)路徑中的定位及作用。上傳的基因中有996個(gè)與537個(gè)信號傳導(dǎo)路徑的67

12、66基因中有效匹配達(dá)14.28％，沒有完全匹配的路徑，我們雖然應(yīng)用是全基因組芯片，幾乎包含了全部已知的人類基因和EST，但我們上傳的是差異表達(dá)基因，因此，沒有匹配的基因不能說沒有表達(dá)，應(yīng)該是這部分基因的表達(dá)值與SW480細(xì)胞接近。 另外，我們篩查出2個(gè)大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選基因：MALAT1和FMNL2。MALAT1是一個(gè)新鑒定的非編碼蛋白，染色體定位于11q13.1。MALAT1僅在SW620組高表達(dá)，可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于M

13、ALAT1的相關(guān)研究文獻(xiàn)較少，它具體的功能和表達(dá)的意義尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在早期非小細(xì)胞肺癌的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，認(rèn)為是早期非小細(xì)胞癌的預(yù)后預(yù)測因子。 綜合分析結(jié)果，參與淋巴轉(zhuǎn)移的大腸癌細(xì)胞似具有：細(xì)胞形態(tài)變形明顯，易于松解；細(xì)胞的黏附、趨向運(yùn)動(dòng)、移動(dòng)調(diào)節(jié)酶活性(蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶)、金屬離子結(jié)合功能下降，核酸代謝、轉(zhuǎn)錄活性增高，表型應(yīng)有：CTNNB1、EGFR、EREG下調(diào)，BCL2L1上調(diào)。 四、CD73

14、、CD24、Hsp27在大腸癌組織的表達(dá)及臨床病理意義 選擇在基因表達(dá)譜表達(dá)上調(diào)的CD73、CD24和Hsp27基因蛋白，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測了20例臨床未轉(zhuǎn)移性大腸癌和19例伴有淋巴結(jié)和肝臟轉(zhuǎn)移大腸癌3個(gè)部位癌組織的表達(dá)，以期評估同源性、不同轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞基因表達(dá)與在大腸癌組織表達(dá)的一致性，同時(shí)探討其臨床病理意義。 對19例大腸癌(含三個(gè)部位癌組織即原發(fā)灶、淋巴結(jié)和肝臟轉(zhuǎn)移灶)的CD24、Hsp27和CD73免疫組

15、化檢測結(jié)果表明，每個(gè)表型在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和肝臟轉(zhuǎn)移灶癌組織的表達(dá)均有顯著差異(P＜0.05～＜0.001)，與SW620和SW480/liver在基因芯片檢測表達(dá)趨勢一致，即CD24在SW620(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)中顯著上調(diào)，Hsp27和CD73在SW480/liver(肝轉(zhuǎn)移)表達(dá)上調(diào)，說明我們應(yīng)用的同源性不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞模型基因表達(dá)與人體大腸癌組織表達(dá)相一致，達(dá)到了初步驗(yàn)證目的。 腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜、連續(xù)和可調(diào)節(jié)的過程，其中涉及

16、了多個(gè)宿主與腫瘤之間的相互作用，也涉及了許多的基因參與。隨著這些基因在大腸癌轉(zhuǎn)移過程中功能逐漸確定，將有助于開發(fā)新的治療策略。 結(jié)論 1，大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移與瘤細(xì)胞形態(tài)明顯變形，絲狀偽足多，易于松解有關(guān)；存在細(xì)胞黏附、趨向運(yùn)動(dòng)、移動(dòng)調(diào)節(jié)酶活性(蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶)、金屬離子結(jié)合等方面功能下降和核酸代謝、轉(zhuǎn)錄活性增高。 2，大腸癌肝轉(zhuǎn)移與瘤細(xì)胞高增生狀態(tài)、較強(qiáng)的同質(zhì)黏附和侵襲能力相關(guān)，瘤細(xì)胞間黏附緊密可能是構(gòu)建肝轉(zhuǎn)移潛能