P--gp高低表達MCF7全二維細胞膜色譜的構(gòu)建與中藥抗乳腺癌成分的篩選研究.pdf

1、乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常見的惡性腫瘤，伴隨著較高的致死率，BC的治療引起人們的廣泛關(guān)注。常規(guī)的治療手段有手術(shù)、放療和化療，但是會引起各種不良反應(yīng)，以及后續(xù)引發(fā)的多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance，MDR)，對患者的身體健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。中藥治療以其多靶點作用、辨證施治、整體調(diào)理等特點在BC的治療過程中可以發(fā)揮重要的輔助作用，目前已經(jīng)有一些中藥單體或復(fù)方應(yīng)用于BC臨床治療，但是仍舊主

2、要依賴于廣大醫(yī)生的臨床經(jīng)驗，發(fā)揮其抗乳腺癌藥效的機制仍不清楚。因此，從中藥中快速篩選出其中發(fā)揮藥效的活性成分，并對其機制進行研究是十分重要的工作。
　　細胞膜色譜(cell membrane chromatography,CMC)是從上世紀九十年代開始發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù)，以細胞膜和硅膠載體作為固定相，采用色譜分析的方法，可在體外模擬小分子化合物與細胞膜受體的相互作用過程。細胞膜色譜法將成分分離與活性篩選相結(jié)合，具有操作

3、方便、快速穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點，尤其適用于中藥等復(fù)雜成分體系的活性篩選。
　　本課題的主要研究內(nèi)容分為以下三個部分:
　　1、P-gp高低表達的MCF7和MCF7/ADR全二維細胞膜色譜系統(tǒng)的構(gòu)建
　　以MCF7和MCF7/ADR兩株細胞為研究對象，用流式細胞術(shù)和Western Blot方法驗證MCF7細胞膜表面P-gp呈低表達水平，MCF7/ADR細胞株呈高表達水平，且無藥培養(yǎng)兩周后表達水平并沒有發(fā)生顯著變化。搭建了

4、經(jīng)APTES修飾的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二維細胞膜色譜系統(tǒng)，同時構(gòu)建硅膠色譜柱和經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱全二維分析系統(tǒng)作為參比，進行系統(tǒng)的有效性和專屬性考察。系統(tǒng)有效性考察結(jié)果顯示，吉非替尼在硅膠色譜柱和經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱上沒有保留行為，但是在MCF7和MCF7/ADR細胞膜色譜柱上有顯著的保留行為;相應(yīng)的，地塞米松在四種色譜柱上均沒有表現(xiàn)出任何保留行為，證明該系統(tǒng)有效性良好。系統(tǒng)的專屬性考察

5、結(jié)果顯示，Tariquidar在硅膠色譜柱、經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱和MCF7細胞膜色譜柱上沒有顯著的保留行為，但是MCF7/ADR細胞膜色譜柱上有顯著的保留行為，顯示該系統(tǒng)有一定的專屬性。可以用于篩選中藥中抗乳腺癌潛在活性化合物。
　　2、基于全二維乳腺癌細胞膜色譜法對中藥抗乳腺癌活性成分的篩選
　　首先選擇了八種有抗乳腺癌作用的中藥材作為對象，構(gòu)建其化學成分庫，制備了中藥提取液，并用HPLC/TOF-MS系統(tǒng)對中藥提

6、取液進行了分離和分析，并且為后續(xù)的全二維分析提供第二維分離的優(yōu)化條件。應(yīng)用經(jīng)APTES修飾-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和經(jīng)APTES修飾-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二維分析系統(tǒng)實現(xiàn)對八種中藥中抗乳腺癌潛在活性成分的篩選，結(jié)果顯示，大黃和黃芩保留成分較多，保留行為較好，因此繼續(xù)以大黃和黃芩為研究對象，完成了保留成分全二維等高線圖譜的繪制和TOF-MS初步鑒定結(jié)果表，并用標準品進行了驗證。結(jié)果顯示，大黃提取

7、液在MCF7細胞膜色譜柱上共有14種保留成分，在MCF7/ADR細胞膜色譜柱上有15種保留成分，其中在兩株細胞都有保留的成分有10種，并對其中食用大黃苷、大黃酚、丹葉大黃素、大黃素甲醚、云杉鞣酚和大黃素六種成分進行了驗證。黃芩提取液在MCF7細胞膜色譜柱上共有15種保留成分，在MCF7/ADR細胞膜色譜柱上有14種保留成分，其中在兩種細胞膜色譜柱都有保留的成分有10種，并對其中的漢黃芩素、黃芩苷、千層紙素A、黃芩素和漢黃芩苷五種成分進行

8、了驗證。為下一步潛在活性成分的藥效驗證研究和活性成分與P-gp之間關(guān)系研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3、潛在活性成分抗乳腺癌活性及其與P-gp的關(guān)系研究
　　根據(jù)全二維MCF7和MCF7/ADR細胞膜色譜系統(tǒng)對中藥大黃和黃芩的篩選結(jié)果，選擇其中可獲得11個化合物為對象。首先對其潛在抗乳腺癌的作用進行體外增殖抑制的藥效驗證，結(jié)果顯示，大黃中丹葉大黃素、云杉鞣酚和大黃素，黃芩中漢黃芩素、黃芩苷、千層紙素A和黃芩素對MCF7和MCF

9、7/ADR兩株細胞均有一定殺傷作用，且對兩株的敏感性不同。進而采用流式細胞術(shù)考察它們是否通過細胞凋亡這個途徑發(fā)揮其殺傷作用。結(jié)果顯示，丹葉大黃素、云杉鞣酚、漢黃芩素和黃芩素是通過凋亡途徑對MCF7細胞產(chǎn)生殺傷作用，而其他化合物則不是。丹葉大黃素、漢黃芩素和千層紙素A是通過凋亡途徑對MCF7/ADR細胞產(chǎn)生殺傷作用，而其他化合物則不是。之后，為了研究同一個化合物對兩株細胞殺傷作用的差異是否與P-gp作用相關(guān)，考察了大黃中丹葉大黃素、云杉鞣