新型轉(zhuǎn)錄因子ZHX2抑制AFP表達(dá)功能片段的尋找及其對細(xì)胞生長作用的研究.pdf

1、研究目的： 尋找新型轉(zhuǎn)錄因子ZHX2抑制AFP表達(dá)的功能片段，并探討其對肝癌細(xì)胞生長的影響，為闡明ZHX2的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為探索新的肝癌基因治療方法提供幫助。 研究方法： 一、新型轉(zhuǎn)錄因子ZHX2抑制AFP表達(dá)功能片段的尋找 1、新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2不同截短片段的克隆表達(dá) ①融合表達(dá)載體p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（2

2、42-501AA）-HA的構(gòu)建 根據(jù)PubMed中人ZHX2 cDNA序列（gi：63079684），利用Primer Premier5．0軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增不同長度ZHX2片段的特異性引物，為便于克隆和表達(dá)，上下游引物分別包含KpnI、EcoRI酶切位點(diǎn)，并在下游引物引入HA-tag序列。以pcDNA-ZHX2-HA的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增人ZHX2基因兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger domains）和前兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域

3、（homoboxes，HD1，HD2），即1-501AA片段、242-338AA片段、242-501AA片段。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)KpnI，EcoRI雙酶切，回收后分別克隆入pcDNA3．0載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經(jīng)酶切、DNA測序分析鑒定，分別命名為p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA， p3ZHX2（242-501AA）-HA。 ②Wester

4、n blot檢測ZHX2不同截短片段在細(xì)胞中的表達(dá) p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA， p3ZHX2（242-501AA）-HA脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2、HepG2．2．15及非洲綠猴腎細(xì)胞COS-7，48h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，以HA單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的抗鼠抗體為二抗，western blot分析ZHX2不同截短片段蛋白的表達(dá)情況。 2、ZHX2不同截短片段

5、蛋白對肝癌細(xì)胞系A(chǔ)FP的抑制作用 ①肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2．2．15中過量表達(dá)ZHX2不同截短片段對AFP的影響 ZHX2不同截短片段的質(zhì)粒p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（242-501AA）-HA分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2．2．15細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，ELISA檢測培養(yǎng)上清中AFP的表達(dá)，同時(shí)western blot檢

6、測細(xì)胞中不同截短片段融合蛋白的表達(dá)。 ②ZHX2不同截短片段蛋白對AFP核心啟動(dòng)子的抑制作用 ZHX2不同截短片段的重組質(zhì)粒各0．3μg分別與0．6μg AFP核心啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒（phAF269）DNA共轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2．2．15細(xì)胞（各孔以pCDNA3．0 DNA將質(zhì)粒補(bǔ)足至1μg），同時(shí)每孔轉(zhuǎn)染20ng的pRL-TK，做為轉(zhuǎn)染率內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶分析。 ③雙熒光素酶報(bào)告

7、基因檢測 按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書將細(xì)胞裂解后與底物混合，用熒光計(jì)數(shù)儀檢測熒光強(qiáng)度M1與熒光強(qiáng)度M2。以M1與M2的比值表示熒光素酶強(qiáng)度。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。 ④統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±stdv表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，當(dāng)P<0．05時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)上具備顯著性差異。 二、ZHX2及ZHX2截短片段蛋白

8、對肝癌細(xì)胞的生長作用的研究 1．CCK-8檢測ZHX2及ZXH2截短片段對肝癌細(xì)胞生長的作用 取生長狀態(tài)良好的HepG2和HepG2．2．15細(xì)胞分別按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，次日ZHX2及其截短片段重組質(zhì)粒p3ZHX2（242-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，分別轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2．2．15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染之后每隔24h，用CCK-8檢測細(xì)胞生長情況，連續(xù)檢測五天，繪制生長曲線

9、觀察ZHX2及其截短片段對細(xì)胞生長的影響。 2．集落形成實(shí)驗(yàn)檢測ZHX2及其功能片段對肝癌細(xì)胞集落形成能力 取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于24孔板中，次日ZHX2全長及功能片段表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2，轉(zhuǎn)染之后24h，將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度接種于六孔板中，靜置培養(yǎng)2-3周，之后用龍膽紫染細(xì)胞，肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。 研究結(jié)果： 一、新型轉(zhuǎn)錄因子ZHX2

10、抑制AFP表達(dá)功能片段的尋找 1、新型轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2不同截短片段的克隆表達(dá) ①成功構(gòu)建三個(gè)融合表達(dá)p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA 以含有全長ZHX2基因的pcDNA3．0-ZHX2-HA質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增ZHX2的三個(gè)不同截短片段，構(gòu)建真核融合表達(dá)質(zhì)粒，命名為：p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（2

11、42-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA。重組質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行單、雙酶切，結(jié)果表明，KpnI/EcoRI雙酶切三種質(zhì)粒，分別可獲得1587bp，338bp，827bp的目的基因片段，與預(yù)期大小一致；進(jìn)一步DNA測序證明三個(gè)重組載體pcDNA-ZHX2（1-501AA）-HA，pcDNA-ZHX2（242-338AA）-HA，pcDNA-ZHX2（242-501AA）-HA構(gòu)建成功。 ②Western

12、blot證實(shí)三種ZHX2片段的融合蛋白可以在真核細(xì)胞有效表達(dá) Western blot結(jié)果顯示p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA轉(zhuǎn)染的HepG2，HepG2．2．15和COS-7細(xì)胞中均有明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和空細(xì)胞的對照組均未見條帶，表明重組質(zhì)粒可以在肝癌細(xì)胞系和非洲綠猴腎細(xì)胞中有效表達(dá)ZXH2不同截短片段。 2、不同截短

13、片段的ZHX2蛋白均可有效抑制AFP表達(dá)，其中242-501AA抑制作用最強(qiáng) ①ZHX2不同截短片段對肝癌細(xì)胞中AFP表達(dá)的抑制作用 ZHX2不同截短片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2，HepG2．2．15細(xì)胞48h后，收集上清，ELISA檢測上清中AFP的表達(dá)。結(jié)果顯示ZHX2不同截短片段均可以抑制肝癌細(xì)胞AFP表達(dá)，其中ZHX2（242-501AA）抑制作用最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染p3ZHX2（242-501AA）-HA的HepG2

14、和HepG2．2．15細(xì)胞中AFP分別為1386．7±193．6ng/ml和1726．2±111．7ng/ml，較全長轉(zhuǎn)染組（1897．4±73．1 ng/ml，1896．1±81．1 ng/ml）顯著降低（p<0．05），抑制率為31．7％+2％。 ②．ZHX2不同截短片段對人AFP啟動(dòng)子活性的抑制作用 ZHX2不同截短片段真核表達(dá)載體與pAFP269報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染HepG2、HepG2．2．15細(xì)胞48h后，收集細(xì)

15、胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，不同ZHX2截短片段均可有效抑制AFP核心啟動(dòng)子活性，其中p3ZHX2（242-501AA）-HA作用最強(qiáng)，抑制率為49．9％±0．9％。 二、ZHX2及其截短片段蛋白抑制肝癌細(xì)胞的體外生長 1．ZHX2及其截短片段抑制肝癌細(xì)胞的生長 ZHX2及其截短片段表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2．2．15和HepG2細(xì)胞后，CCK-8連續(xù)監(jiān)測五天，結(jié)果顯示ZHX2及其截短片段均可以抑制肝癌

16、細(xì)胞生長，其中242-501AA片段抑制作用最強(qiáng)，第5天時(shí)，較空載體轉(zhuǎn)染組，抑制率為15％。 2．ZHX2及其功能片段抑制肝癌細(xì)胞的集落形成 ZHX2及其功能片段表達(dá)質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZHX2及其功能片段均具有體外抑制腫瘤細(xì)胞集落形成的能力，較ZHX2全長及空載體對照組相比，242-501AA片段抑制作用最強(qiáng)，較空載體組抑制率為83％。 結(jié)論及意義： 1．本研究成功

17、構(gòu)建了三個(gè)可以在體外有效表達(dá)ZHX2不同截短片段融合蛋白的真核表達(dá)載體p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（242-501AA）-HA，三種載體的構(gòu)建為進(jìn)一步研究ZHX2的功能提供了必要的條件。 2．本研究首次證明ZHX2（242-501AA）片段是對AFP有較強(qiáng)抑制作用的功能片段，為進(jìn)一步深入研究ZHX2結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)肝癌治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。