新型轉錄抑制因子ZHX2對肝癌細胞系中AFP的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究目的： 探討新型轉錄抑制因子ZHX2抑制肝癌細胞系中AFP表達的作用，并對其作用機制進行初步探討，為研究肝臟特異性基因表達調控機制和尋找新的肝癌臨床檢測指標奠定基礎。 研究方法： 一、新型轉錄抑制因子ZHX2的克隆表達 1．融合表達載體pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA的構建設計兩對ZHX2特異性引物，分別包含EcoR Ⅰ、Sac Ⅱ酶切位點和Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位點，其中后一對

2、中的下游引物含有HA-tag序列。以人肝mRNA為模板，PCR擴增人ZHX2的基因和ZHX2-HA基因，PCR產物分別經EcoR Ⅰ、SacⅡ和Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切，回收后分別克隆入pEGFP-N1載體和pcDNA3.0載體。連接產物轉化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經酶切、PER、DNA測序分析鑒定。 2．熒光顯微鏡和Western blot方法檢測ZHX2蛋白水平的表達pEGFP-ZHX2轉染后

3、48h，熒光顯微鏡觀察其在COS-7中的表達情況：pcDNA-ZHX2-HA質粒轉染細胞48h后，提取總蛋白質，western blot分析ZHX2-HA蛋白的表達情況。 二、ZHX2蛋白在肝癌細胞系中對AFP的抑制作用研究 1．ELISA和RT-PER檢測不同細胞系中AFP和ZHX2 mRNA的表達同等量的細胞(HepG2、HepG2.215、SMMC7721、LO2、SW480、MCF-7)在24孔板內培養(yǎng)48h后，

4、收集細胞上清，ELISA方法檢測其AFP的表達量，BCG法檢測其對應的白蛋白(ALB)表達量。同時提取細胞總RNA，RT-PER分析各細胞系ZHX2 mRNA的表達。 2．肝癌細胞系HepG2、HepG2.215中過量表達ZHX2對AFP的影響不同量pcDNA-ZHX2-HA(0、0.25、0.5、lug)轉染肝癌細胞系HepG2、HepG2.215，48h后，收集細胞上清，ELISA檢測其中AFP、ALB的表達情況。同時Wes

5、tern blot分析細胞中ZHX2－HA蛋白的表達情況。 3．針對ZHX2的SiRNAs表達載體的構建及其對ZHX2的抑制效果由廣州綠陽公司設計并合成了兩對針對ZHX2 cDNA序列的寡核苷酸，退火后克隆入含有H1啟動子的pSilencer<'TM>3.1-H1 neo載體，構建針對ZHX2的siRNA表達載體ps1674和ps2360，重組子經測序鑒定。 pcDNA-ZHX2-HA分別與ps1674、ps2360、

6、陰性對照 (negative control) 和pSilencer3.1空質粒共轉染HepG2細胞，并設立空細胞對照組，48h后，Westernblot分析細胞中ZHX2-HA蛋白的表達情況，從而檢測siRNAs的干擾作用。 4．ELISA和RT-PCR分別分析SiRNAs干擾ZHX2后AFP和ZHX2 mRNA的變化SiRNAs及其陰性對照質粒分別轉染肝癌細胞SMMC7721和正常肝永生化細胞L02，并設立空細胞對照，56h

7、后，檢測細胞上清中AFP的變化，并同時RT-PCR檢測細胞中ZHX2的表達情況。 三、ZHX2蛋白對AFP啟動子抑制作用機制的初步探討 1.構建含有AFP啟動子核心區(qū)的報告質粒首先設計包含有KpnI和XhoI酶切位點的針對AFP啟動子核心區(qū)的特異性引物(AFP-F和AFP-R)，以人基因組為模板，PCR擴增人AFP啟動子的核心序列，PCR產物經KpnI和XhoI雙酶切，回收后克隆入pGL3-Basic載體，構建報告質粒D

8、hAF269，連接產物轉化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經PCR、DNA測序分析鑒定。 2.phAF269的活性和特異性檢測phAF269、ph5040(陽性對照，由日本Hidekazu Nakabayashi博士(Departmentof Biochemistry，Hokkaido University School of Medicine)惠贈。)、pGL3-Basic(陰性對照)分別轉染HepG2和CO

9、S-7，同時每孔轉染pRL-TK 20ng作為轉染率內參照，轉染48h后收集細胞，進行雙熒光素酶檢測實驗。 3．新型轉錄抑制因子ZHX2對AFP啟動子核心區(qū)的抑制作用不同量的重組質粒pcDNA-ZHX2-HA(0μg、0.1μg、0.2μg、0.3 μg、0.4μg)，分別與0.6μg phAF269質粒DNA共轉染HepG2細胞(各孔以pCDNA3.0 DNA將質粒補足至1μg)，同時每孔轉染pRL-TK 20ng做為轉染率內

10、參照。轉染48h后，收集細胞，進行雙熒光素酶檢測實驗。 4.構建含有AFP啟動子核心區(qū)突變體的報告質粒設計兩個含有HNFl突變位點的針對AFP啟動子核心區(qū)的特異性下游引物AFP-A1-R和AFP-A2-R。 5．雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)尋找ZHX2與AFP啟動子核心區(qū)的作用位點含有AFP啟動子核心區(qū)突變體的報告質粒(0.6μg)，與pcDNA-ZHX2-HA(0.3μg)共轉染HepG2細胞，48h后收集細胞，進行雙熒

11、光素酶檢測實驗。 6．雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)檢測 按雙報告基因試劑盒說明書將細胞裂解后與底物混合，用熒光計數儀檢測熒光強度M1與熒光強度M2。以M1、M2比值表示熒光素酶表達強度。每次實驗設2個復孔，同一轉染實驗至少重復3次。 7．統(tǒng)計分析 采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行數據處理，實驗數據以x±s表示，各組間比較采用t檢驗進行處理，當P<0.05時，統(tǒng)計學上具備顯著性差異。 研究結果 一

12、、新型轉錄抑制因子ZHX2的克隆表達。 二、ZHX2蛋白抑制肝癌細胞系中AFP表達。 三、ZHX2蛋白對AFP啟動子抑制作用機制的初步探討。 結論及意義： 本研究成功構建了兩種可以在體外有效表達ZHX2融合蛋白的表達載體pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA，瞬時轉染COS-7細胞后，利用熒光顯微鏡和western blot檢測到了融合蛋白的表達，克服了目前尚沒有ZHX2抗體的困難，為進一步研究