漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性功能及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　心臟瓣膜疾病是一類(lèi)由各種原因引起的瓣膜結(jié)構(gòu)破壞和功能失調(diào)并嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病,人工心臟瓣膜置換是其主要治療方法,全世界每年逾45萬(wàn)例患者接受換瓣治療。目前臨床上使用的人工心臟瓣膜主要分為兩類(lèi):機(jī)械瓣膜和生物瓣膜。雖然它們都能部分替代原有瓣膜的功能從而改善患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)患者生命,但是由于其自身材料和結(jié)構(gòu)等缺陷難以完美替代自身瓣膜并存在多種并發(fā)癥和后遺癥。機(jī)械瓣膜置換后需要終生抗凝,因抗凝不當(dāng)易引起出血、血栓和栓塞

2、;生物瓣膜的血流動(dòng)力學(xué)性能好,但因鈣化和衰壞易導(dǎo)致生物瓣功能障礙,需要10到15年后再次進(jìn)行瓣膜置換。因此研制有生長(zhǎng)和修復(fù)能力的組織工程心臟瓣膜(TEHV)已成為心臟瓣膜研制的主要方向。然而,目前研制的TEHV體內(nèi)移植后均無(wú)法適應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境,不能耐受高壓、高速血流的沖擊。
　　生物力學(xué)信號(hào)是心臟瓣膜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一種重要的細(xì)胞外調(diào)控信號(hào),使瓣膜細(xì)胞隨著發(fā)育逐步適應(yīng)高壓高速的血流力學(xué)環(huán)境。如何系統(tǒng)模擬瓣膜生理發(fā)育過(guò)程中逐漸增

3、高的壓力和血流速度變化等力學(xué)信號(hào)調(diào)控過(guò)程,在 TEHV體外構(gòu)建的過(guò)程中從種子細(xì)胞培養(yǎng)分化開(kāi)始就進(jìn)行仿生性力學(xué)漸進(jìn)性系統(tǒng)訓(xùn)練、調(diào)控,逐步增強(qiáng)種子細(xì)胞適應(yīng)高壓、高速血流沖擊的能力,對(duì)研究 TEHV及其它須面對(duì)體內(nèi)復(fù)雜應(yīng)力環(huán)境的組織工程器官具有重大意義。
　　目的：
　　本課題研究漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對(duì) MSCs活性、功能和分化等的影響及相關(guān)機(jī)制,尋找細(xì)胞內(nèi)力學(xué)信號(hào)作用的關(guān)鍵分子,為基因改造優(yōu)化種子細(xì)胞提供理論基礎(chǔ),探索可顯著改善MSC

4、s耐受高壓、高速血流沖擊的仿生性力學(xué)訓(xùn)練系統(tǒng)方案。
　　方法和結(jié)果
　　第一部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對(duì)MSCs活性功能的影響
　　培養(yǎng)的大鼠MSCs分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別接受0、5、10和15dyn/cm2剪應(yīng)力及漸進(jìn)性增加剪應(yīng)力0~10和0~15 dyn/cm2處理。Brdu法檢測(cè)細(xì)胞增殖,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移,Elisa檢測(cè)細(xì)胞分泌,貼壁率檢測(cè)細(xì)胞粘附及 Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:與靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs相比,高恒定剪應(yīng)力(

5、15dyn/cm2)提高細(xì)胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均<0.05),同時(shí)顯著提高M(jìn)SCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細(xì)胞因子水平(P值均<0.01)。與單純高剪應(yīng)力(15dyn/cm2)干預(yù)的MSCs相比,0~15 dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高細(xì)胞增殖率、遷移率和粘附率(P值均<0.05),同時(shí)提高M(jìn)SCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF細(xì)胞因子水平(P值均<0.05)。單純高剪應(yīng)力(15dyn/

6、cm2)干預(yù)的MSCs相比靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.01),而0~15 dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以顯著減少細(xì)胞凋亡(P<0.01)。
　　第二部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)增強(qiáng)MSCs活性機(jī)制研究
　　Western-blot檢測(cè)PIM-1等目的蛋白表達(dá),采用siRNA和蛋白抑制劑探索相關(guān)分子機(jī)制,transwell研究細(xì)胞分泌變化對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果:0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高PIM-1蛋白表

7、達(dá)以及Akt、p38和ERK蛋白磷酸化水平(P值均<0.05),加入Akt、p38和ERK蛋白抑制劑后,研究發(fā)現(xiàn)p38和ERK蛋白被抑制時(shí)PIM-1蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01),通過(guò)siRNA抑制PIM-1基因發(fā)現(xiàn)漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs增殖率下降(P<0.01)。Transwell結(jié)果顯示0~15 dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)顯著提高M(jìn)SCs遷移率(P<0.05),提示 MSCs細(xì)胞分泌水平提高可能促進(jìn)了細(xì)胞遷移。0~15dyn/

8、cm2漸進(jìn)性力學(xué)干預(yù)后,MSCs中纖連蛋白(FN)和玻璃粘連蛋白(VN)的表達(dá)增加(P<0.05),提示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可能通過(guò)增加這兩種粘附蛋白的表達(dá)促進(jìn)MSCs粘附能力提升。
　　第三部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)對(duì)衰老MSCs活性功能影響
　　取4周齡SD大鼠和24月齡SD大鼠MSCs,研究衰老對(duì)MSCs生長(zhǎng)狀態(tài)以及耐受剪應(yīng)力的影響。給予抗氧化劑干預(yù)后,記錄細(xì)胞群體倍增數(shù),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OH

9、dG)和蛋白質(zhì)金屬羰基合物(protein carbonyls)水平,并通過(guò)real time PCR檢測(cè)p16和p53基因表達(dá)。對(duì)不同組MSCs分別施加漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng),觀察細(xì)胞增殖、遷移、分泌、粘附和凋亡的情況。結(jié)果:與4周齡SD大鼠來(lái)源MSCs相比,24月齡SD大鼠來(lái)源MSCs群體倍增數(shù)(PD)明顯下降(P<0.01),細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著升高(P<0.05),p16和p53基因表達(dá)增加(P<0.05)。在使用抗氧化劑干預(yù)后,細(xì)胞

10、內(nèi)氧化應(yīng)激強(qiáng)度下降(P<0.05),p16和p53基因表達(dá)水平下降(P<0.05),群體倍增數(shù)增加(P<0.05)。24月齡SD大鼠來(lái)源MSCs在接受漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后,MSCs活性功能未明顯提高,凋亡增加(P<0.05);給予抗氧化劑干預(yù)后,漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高衰老MSCs活性功能及減少凋亡(P<0.05)。
　　第四部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞分化及其機(jī)制研究
　　漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo) MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化,免疫熒光染

11、色法觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞是否表達(dá)平滑肌樣細(xì)胞特異性標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)和鈣調(diào)蛋白(Calponin),real time PCR分析SMA和Calponin基因表達(dá),通過(guò)特異性蛋白抑制劑探索相關(guān)機(jī)制。結(jié)果:SMA和Calponin免疫熒光染色陽(yáng)性,提示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)誘導(dǎo)MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化。Real time PCR結(jié)果顯示漸進(jìn)性力學(xué)處理后SMA和Calponin基因表達(dá)顯著增加(P<0.01),漸進(jìn)性力和TGF-β1

12、處理提高這兩種基因表達(dá)(P<0.01)。PD98059(ERK阻斷劑)抑制MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化(P<0.05),提示ERK分子信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第五部分漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)MSCs種植后在體研究
　　將漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs和未經(jīng)力學(xué)適應(yīng)MSCs分別種植于脫細(xì)胞豬主動(dòng)脈壁上。采用仿生脈動(dòng)生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)力學(xué)環(huán)境處理血管后,分光光度法檢測(cè)DNA含量,western blot檢測(cè)I型膠原含量

13、。將MSCs種植于脫細(xì)胞帶瓣管道上并移植于犬腹主動(dòng)脈,1月后行 B超觀察,并取組織標(biāo)本行大體觀察、HE染色、DNA和膠原含量測(cè)定。結(jié)果:在體外模擬實(shí)驗(yàn)中,漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后的MSCs在主動(dòng)脈壁上存留較多,DNA含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01),Western blot結(jié)果顯示漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后MSCs的I型膠原含量明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P<0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種移植物均無(wú)血栓形成,力學(xué)適應(yīng)后MSCs在移植物上存留較多,DNA含量明顯高

14、于對(duì)照組(P<0.01),分泌膠原含量也顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P<0.01)。說(shuō)明力學(xué)適應(yīng)后 MSCs接種于支架材料后可較好耐受高速、高壓流體力的沖擊。
　　結(jié)論：
　　1.本研究系統(tǒng)探索了恒定剪應(yīng)力和漸進(jìn)性增加剪應(yīng)力對(duì)培養(yǎng)MSCs的作用,發(fā)現(xiàn)隨著0、5、10和15dyn/cm2剪應(yīng)力強(qiáng)度逐漸增加, MSCs的增殖、遷移、分泌和粘附能力經(jīng)過(guò)力學(xué)訓(xùn)練后得到提高,0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以進(jìn)一步提高細(xì)胞增殖、遷移、分

15、泌和粘附能力,同時(shí)0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)相比于同等強(qiáng)度下的高恒定剪應(yīng)力可以減少細(xì)胞凋亡。
　　2.研究證實(shí)0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可激活 p38和 ERK信號(hào)通路調(diào)控的PIM-1蛋白表達(dá)從而促進(jìn)MSCs增殖,提高了MSCs的自分泌能力使其遷移能力增強(qiáng),并且促進(jìn)FN和VN蛋白表達(dá)使MSCs粘附能力提高,初步闡明了漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高M(jìn)SCs活性功能的機(jī)制。
　　3.研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠來(lái)源 MSCs比青年大

16、鼠來(lái)源 MSCs氧化應(yīng)激水平升高、DNA和蛋白質(zhì)損傷加重以及活性功能下降。在接受0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)后,老年大鼠來(lái)源 MSCs活性功能未見(jiàn)顯著提高,凋亡率也明顯上升。給予抗氧化劑干預(yù)后,0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)提高老年大鼠來(lái)源MSCs活性功能并減少凋亡。
　　4.0~15dyn/cm2漸進(jìn)性力學(xué)適應(yīng)可以在體外培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)MSCs向平滑肌樣細(xì)胞方向分化,這種誘導(dǎo)能力在結(jié)合 TGF-β1后得到進(jìn)一步增強(qiáng),ER