CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對破骨細胞分化、功能及其分泌物金屬基質(zhì)蛋白酶的影響.pdf

1、目的：
　　 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一組全身性的骨骼疾病,其特征是骨量減少或(和)骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,從而導(dǎo)致骨強度下降,骨脆性增加,最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生。OP發(fā)生的根本原因是骨吸收速度超過骨形成。而破骨細胞(osteoclasts,Ocs)在骨吸收過程中起著關(guān)鍵性作用。
　　 Ocs來源于單核/巨噬細胞譜系中的定向造血干細胞,該類細胞在巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-sti

2、mulating factor,M-CSF)和細胞核因子κB活化因子配體(nuclear factor κ B activation factor ligand,RANKL)的作用下逐漸分化為成熟OCs。成熟Ocs通過分泌多種金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix matalloproteinases,MMPs)降解骨基質(zhì)而發(fā)揮其骨吸收功能。而在MMPs中,MMP-2,3,7,9,13可能具有重要作用。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細

3、胞是一種具有高度抑制功能的T細胞,是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的主要作用細胞。根據(jù)對已有文獻的理解,我們認為,Ocs與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞之間應(yīng)該具有必然的聯(lián)系。首先,OCs來源于單核/巨噬細胞,其本質(zhì)上歸屬于抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells,APC),而作為T細胞的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對OCs理論上應(yīng)該具有調(diào)節(jié)作用;其次,多個文獻報告,在多種免疫疾病中,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid a

4、rthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)及炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)等患者常伴隨明顯的骨質(zhì)疏松,而該類患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)目則有所下降。
　　 基于以上理解,我們研究了小鼠CIM+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對OCs分化及其分泌MMPs的影響,旨在從免疫學(xué)的角度說明骨質(zhì)疏松發(fā)生的一方面機制。

5、>　　 方法：
　　 1、免疫磁珠法(magnetic cell sorting,MACS)分選細胞
　　 利用MACS方法分別從小鼠脾臟及骨髓中分選出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD4+CD25-T細胞和CD11b+細胞。利用相應(yīng)熒光抗體標記后,流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測細胞純度。將細胞置于適宜環(huán)境中分別培養(yǎng)。
　　 2、T細胞與CD11b+細胞共培養(yǎng)
　　 CD11b

6、+細胞在含有M-CSF、RANKL和骨片的培養(yǎng)體系中單獨培養(yǎng)3天后,分別與CD3抗體激活的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞或CD4+CD25-T細胞按照相應(yīng)比例共培養(yǎng)4天。
　　 3、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對OCs分化的作用
　　 共培養(yǎng)4天后,進行酒石酸酸性磷酸酶(tartrate acid phosphate,TRAP)染色,觀察OCs形態(tài),同時計數(shù)OCs數(shù)目;對骨片進行甲苯胺藍染色,觀察吸收陷窩的形態(tài),計數(shù)吸

7、收陷窩數(shù)目并測量吸收面積。
　　 4、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對OCs分泌MMPs的作用
　　 共培養(yǎng)2天后,利用酶聯(lián)免疫分析的(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測培養(yǎng)上清中MMP-2,3,7,9的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1、MACS分選細胞純度
　　 根據(jù)流式結(jié)果,利用MACS方法分離得到的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、CD4+C

8、D25-T細胞和CD11b+細胞的純度均在90%以上。
　　 2、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對Ocs分化的作用
　　 (1)TRAP染色的結(jié)果顯示,與CD4+CD25-T細胞相比,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞能顯著抑制OCs的生成(p＜0.01)。
　　 (2)甲苯胺藍染色的結(jié)果顯示,與CD4+CD25-T細胞相比,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞能顯著抑制Ocs吸收陷窩的形成,并能顯著減少吸收面積(p＜0.