流體切應(yīng)力對破骨細(xì)胞CaⅡ、Cat K mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，口頜系統(tǒng)處于復(fù)雜而精密調(diào)控的應(yīng)力應(yīng)變環(huán)境，許多生理過程和病理變化，如牙萌出、牙正畸性移動、種植體周圍炎、牙周炎等，與機(jī)械應(yīng)力應(yīng)變關(guān)系密切。機(jī)械刺激下發(fā)生的局部改建維持和重塑骨組織的結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)外部力學(xué)環(huán)境的不斷變化。目前，骨細(xì)胞對載荷的反應(yīng)特征及機(jī)械信號傳導(dǎo)的機(jī)制仍不清楚。生理性載荷不僅產(chǎn)生梯度張力，也產(chǎn)生局部梯度壓力，從而導(dǎo)致骨組織縫隙內(nèi)的流體切應(yīng)力。局部的流體切應(yīng)力在骨組織的改建中發(fā)揮重要作用。研究骨細(xì)胞對不同載荷的

2、反應(yīng)特征、力學(xué)信號在細(xì)胞中的傳導(dǎo)機(jī)制，是深入研究骨改建機(jī)理的重要內(nèi)容，相關(guān)的細(xì)胞力學(xué)研究已成為口腔醫(yī)學(xué)、骨科學(xué)等諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 由于破骨細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，細(xì)胞脆弱，組織含量少，目前尚不能傳代，體外培養(yǎng)和純化比較困難。而在體外獲得高產(chǎn)量高純度的破骨細(xì)胞又是進(jìn)行分子生物學(xué)等相關(guān)研究的必要條件。因此，破骨細(xì)胞的分離純化成為進(jìn)行分子水平的破骨細(xì)胞力學(xué)研究的技術(shù)瓶頸，也是相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。目前，在破骨細(xì)胞的培養(yǎng)和純化方面，尚未見

3、實(shí)驗(yàn)動物年齡對培養(yǎng)質(zhì)量的影響作用和對骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠破骨細(xì)胞純化的報道。Ca Ⅱ和Cat K是破骨細(xì)胞主要的功能性酶，在骨組織泌酸脫礦和骨有機(jī)質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)流體切應(yīng)力作用下破骨細(xì)胞CaⅡ、Cat K表達(dá)水平的報道。本研究針對相關(guān)內(nèi)容分三部分進(jìn)行了探索： ①l,25-(OH)<,2>維生素D<,3>聯(lián)合地塞米松誘導(dǎo)SD大鼠骨髓破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)：以常用劑量的1，25-(OH)<,2>D<,3>(10<

4、'-7>mol／L)和DexamethaSOlle(10<'-8>mol／L)作為誘導(dǎo)劑，分別以1,25-(OH)<,2>D<,3>，單獨(dú)誘導(dǎo)和1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導(dǎo)SD大鼠骨髓細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)分析、Trap染色、掃描電鏡和甲苯胺藍(lán)染色鑒定破骨細(xì)胞。單一組和聯(lián)合組均獲得Trap染色陽性、體外具有噬骨能力的多核破骨細(xì)胞。通過對培養(yǎng)第7天Trap陽性多核破骨樣細(xì)胞計數(shù)值的統(tǒng)計分析，驗(yàn)證了在體外

5、培養(yǎng)破骨細(xì)胞方面，1,25-(OH)<,2>D<,3>。聯(lián)合DexamethaSOYle誘導(dǎo)優(yōu)于1,25-(OH)<,2>D<,3>單獨(dú)誘導(dǎo)。 ②胰酶消化法純化誘導(dǎo)不同年齡段SD大鼠骨髓破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)：以1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導(dǎo)不同年齡段SD大鼠骨髓細(xì)胞，各年齡段SD大鼠均可獲得Trap陽性、具有噬骨能力的多核破骨細(xì)胞。不同年齡段SD大鼠的骨髓細(xì)胞對體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的效果有影響。

6、在第l至第36天年齡段，年齡越小，細(xì)胞活性越強(qiáng)。1,25-(OH)<,2>D<,3>/examethasorle誘導(dǎo)出生后10-12天的SD大鼠骨髓細(xì)胞，可保證細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可操作性，獲得較高產(chǎn)量的破骨細(xì)胞。采用胰蛋白酶／EDTA消化法純化，可獲得高純度的1,25-(OH)<,2>D<,3>／Dexamethasorle誘導(dǎo)的SD大鼠破骨細(xì)胞。 ③流體切應(yīng)力與破骨細(xì)胞Ca Ⅱ、Cat K的表達(dá)：采用平行平板流體切應(yīng)力加載系統(tǒng)

7、(專利號：200420034438)，以無血清的a-MEM音養(yǎng)基作為流動介質(zhì)，對胰蛋白酶／EDTA消化法純化后的1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠(出生10-12天)破骨細(xì)胞，施加不同力值和作用時間的穩(wěn)定流體切應(yīng)力，采用實(shí)時熒光定量巢式PCR檢測Ca Ⅱ、Cat K mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著力值的增加和作用時間的延長，Ca Ⅱ、Cat K mRNA的表達(dá)量均呈下降趨勢，各組樣本問的