基于豬丁型冠狀病毒S1蛋白抗原的間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用及NS6蛋白多克隆抗體的制備.pdf

1、丁型冠狀病毒（Deltacoronavirus）在2011年劃分為第四種冠狀病毒屬。豬丁型冠狀病毒(PDCoV)是豬腸道疾病病原，能感染各年齡段的豬群，引起與豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎相似的腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀。
　　自2011年P(guān)DCoV在香港被首次報(bào)道以來(lái)，美國(guó)，韓國(guó)，泰國(guó)以及中國(guó)內(nèi)地均相繼有報(bào)道，PDCoV的大范圍爆發(fā)給各地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，給公共衛(wèi)生安全埋下隱患。
　　本研究用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的PDCoV S1

2、蛋白為包被抗原建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)方法，檢測(cè)了來(lái)自浙江、河南、黑龍江等7個(gè)省份地區(qū)的腹瀉豬臨床血清樣品，調(diào)查了PDCoV的感染率;又采用原核系統(tǒng)成功表達(dá)PDCoV NS6蛋白，并制備抗NS6蛋白多克隆抗體，并利用該多克隆抗體檢測(cè)PDCoV感染體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)NS6蛋白的表達(dá)。
　　1、PDCoV-S1蛋白間接ELISA方法的建立與應(yīng)用

3、　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增豬丁型冠狀病毒(PDCoV)湖南株S1基因，與pFast-bac質(zhì)粒相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞得到重組質(zhì)粒Bacmid-S1。重組質(zhì)粒Bacmid-S1轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后，產(chǎn)生重組桿狀病毒。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot，WB)驗(yàn)證成功獲得分泌性S1蛋白。利用Ni-NAT親和層析方法，得到純化的S1蛋白。用該蛋白建立間接

4、ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)2015～2016年間收集的來(lái)自江蘇、湖南、江西、河南、浙江、黑龍江和山東7個(gè)省份的609份具有腹瀉癥狀的豬血清樣品，結(jié)果顯示，抗PDCoV S1抗體檢出率為44.17％(269/609)。
　　2、PDCoV NS6蛋白的多克隆抗體制備
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR方法擴(kuò)增豬丁型冠狀病毒湖南株NS6基因，將其克隆至pET28a載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-PDCoV-NS6。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)B

5、L21細(xì)胞，進(jìn)行原核表達(dá)，獲得以包涵體形式表達(dá)的NS6蛋白，通過(guò)Ni-NTA親和純化柱，采用咪唑結(jié)合法pH梯度洗脫純化NS6蛋白。以純化的NS6蛋白作為免疫抗原，對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫，免疫四次后，ELISA檢測(cè)兔血清抗體效價(jià)為1∶6400;將獲得的抗NS6蛋白的多克隆抗體即含抗NS6蛋白抗體的兔血清，應(yīng)用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirect immunoinfluscent assay，IFA)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot