利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與禽呼腸孤病毒σA蛋白相互作用的宿主蛋白及其初步驗(yàn)證.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)可感染雞與火雞，從而引起病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、慢性呼吸道疾病、矮小癥等多種疾病。同時(shí)，ARV的感染還會(huì)導(dǎo)致消化道紊亂，飼料轉(zhuǎn)化效率低下，腹瀉，生長(zhǎng)遲緩等癥狀，也可以引起免疫性抑制。σA蛋白是由S2基編碼的ARV結(jié)構(gòu)蛋白，研究表明，σA蛋白與ARV病毒抗干擾素作用有關(guān)，但其對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控作用及對(duì)ARV復(fù)制的影響還有待進(jìn)一步探討。研究與σA蛋白相互作用的宿主蛋白，為進(jìn)一步揭示ARV的分子

2、致病機(jī)理提供理論依據(jù)。本研究采用酵母雙雜交技術(shù)，篩選出與禽呼腸孤病毒σA蛋白相互作用的宿主蛋白。抽提ARV S1133株RNA，獲得ARV病毒的RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增σA基因，將其與線性pGBKT7載體連接，構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-σA，并對(duì)重組誘餌質(zhì)粒進(jìn)行毒性效應(yīng)檢測(cè)和自激活檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證重組質(zhì)粒可以用于后續(xù)酵母雙雜交篩選互作蛋白。利用CLONTECH SMART技術(shù)構(gòu)建了SPF雞肝臟組織的cDNA文庫(kù)，并且對(duì)所構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行

3、質(zhì)量檢測(cè)，所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)庫(kù)容為2.4×106cfu，文庫(kù)滴度為1.30×107cfu/mL，重組率約為100％，文庫(kù)的平均插入片段約為1.0kb，構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量高，可用于酵母雙雜交篩選。應(yīng)用經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格的SPF雞肝組織cDNA文庫(kù)與無(wú)毒性和無(wú)自激活效應(yīng)的重組質(zhì)粒pGBKT7-σA進(jìn)行雜交。共篩選出11種互作蛋白，并對(duì)部分蛋白進(jìn)行了分析和初步驗(yàn)證。本研究初步篩選出11種與ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白，為進(jìn)一步研究ARV病毒的分