靶向抗腫瘤耦聯(lián)物苯丙胺酸氮芥—己二酸橋—偕二磷酸的靶向性及療效實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究的目的在于開發(fā)一種新型的靶向抗腫瘤藥物，將親骨性載體二膦酸鹽與化療藥物苯丙胺酸氮芥耦聯(lián)，并將放射性核素<'153>Sm與耦連物鰲合，合成一種雙膦酸鹽和親骨核素為導(dǎo)向、化療藥物和B射線協(xié)同發(fā)揮作用的骨腫瘤靶向治療系統(tǒng)，特異性識(shí)別、殺滅惡性骨腫瘤細(xì)胞，全身其它非靶向臟器藥物濃度低，毒副作用小，達(dá)到高效低毒治療骨腫瘤的目的。并通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證合成耦聯(lián)物的生物效應(yīng)，為以后的臨床試驗(yàn)用藥提供理論依據(jù)。 方法： (1

2、)耦連物的合成及鑒定：將苯丙胺酸氮芥與二膦酸鹽耦聯(lián)，<'153>Sm與耦聯(lián)物鰲合，合成新的耦聯(lián)物，采用核磁共振儀、紅外光譜儀、質(zhì)譜分析，確定其組分、相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)鑒定；羥基磷灰石晶體吸附實(shí)驗(yàn)和荷瘤鼠體內(nèi)分布顯像實(shí)驗(yàn)，了解耦聯(lián)物體內(nèi)外的親骨性能。 (2)耦聯(lián)物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：①體外培養(yǎng)觀察不同濃度的耦連物對(duì)成骨細(xì)胞的影響；②采用MTT、細(xì)胞活力分析、丫啶橙染色、流式細(xì)胞術(shù)、掃描電鏡，觀察不同濃度的耦連物對(duì)MG-63細(xì)胞增殖和凋亡的

3、影響。 (3)裸鼠體內(nèi)耦連物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究：①用γ免疫計(jì)數(shù)儀、高效液相色譜儀分析測(cè)定靶組織(骨、腫瘤)和非靶組織(心、肝、腎)藥物濃度，研究偶聯(lián)物在小鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)分布規(guī)律和骨靶向性；②不同濃度耦連物對(duì)腫瘤的影響，計(jì)算抑瘤率；③RT-PCR和Western blot法，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組caspase-3基因、C-myc基因表達(dá)差異。 結(jié)果： (1)耦連物的合成及鑒定：對(duì)合成的耦聯(lián)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行核磁共振波譜分析，得出

4、的光譜數(shù)據(jù)符合藥物合成的要求；耦聯(lián)物在體外對(duì)羥基磷灰石具有良好的吸附性能，在體內(nèi)骨骼系統(tǒng)和血流豐富的臟器，尤其是腫瘤部位高度濃聚。 (2)耦聯(lián)物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：①不同濃度的耦聯(lián)物對(duì)成骨細(xì)胞的貼壁率、體外克隆形成及細(xì)胞活力無(wú)明顯影響， MTT實(shí)驗(yàn)顯示耦聯(lián)物各濃度組的成骨細(xì)胞OD值逐日增高，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。②MG-63骨肉瘤細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)顯示：不同濃度的耦聯(lián)物及苯丙胺酸氮芥作用下的骨肉瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24到96小時(shí)

5、培養(yǎng)后，OD值均減小，其中2000ug/ml濃度的耦聯(lián)物組及陽(yáng)性對(duì)照組在同一時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)。細(xì)胞活力分析顯示活細(xì)胞比例明顯降低。24小時(shí)內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)各濃度組細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；24小時(shí)，400ug/ml、2000ug/ml組與陽(yáng)性對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05)；48小時(shí)，4ug/ml、400ug/ml、2000ug/ml組與陽(yáng)性對(duì)照組間有顯著性差異(P<0.05)。丫啶橙染色結(jié)果：隨著藥物濃度提高

6、和作用時(shí)間延長(zhǎng)，可見凋亡小體形成。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：耦聯(lián)物濃度為40ug/ml，苯丙胺酸氮芥濃度20ug/ml作用過(guò)的MG--63骨肉瘤細(xì)胞從24到96小時(shí)，凋亡率逐漸增高。電鏡觀察結(jié)果：對(duì)照組可見骨肉瘤細(xì)胞核完整規(guī)則，實(shí)驗(yàn)組隨作用藥物濃度及作用時(shí)間增加，出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞。 (3)裸鼠體內(nèi)耦連物抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究：①小鼠體內(nèi)放射性計(jì)數(shù)分布顯示骨組織中的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它臟器，在3小時(shí)左右藥物在骨組織中的濃度達(dá)到峰值。荷瘤裸鼠各個(gè)臟

7、器中放射性計(jì)數(shù)在腫瘤組織中最高，其次為骨組織，再次為性腺、脾、肺等臟器。②經(jīng)耦聯(lián)物及苯丙胺酸氮芥作用后，裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，實(shí)驗(yàn)組高中劑量組與對(duì)照組間瘤重有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率分別是37.85％、32.02％、16.16％和17.11％。高、中劑量組腫瘤抑制率均大于30％。大體觀察發(fā)現(xiàn)耦聯(lián)物處理組的裸鼠飲食及精神等狀況均優(yōu)于苯丙胺酸氮芥處理組。③耦連物組腫瘤組織中Caspase-3的表達(dá)明顯高于對(duì)照

8、組(P<0.05)：用藥組C-myc癌基因的mRNA較對(duì)照組下降了3.26倍。 結(jié)論： 1.新合成的耦聯(lián)物符合原藥的功能結(jié)構(gòu)特征；羥基磷灰石體外吸附試驗(yàn)、核素153Sin標(biāo)記耦聯(lián)物荷瘤鼠體內(nèi)分布顯像實(shí)驗(yàn)確定該耦聯(lián)物具有骨靶向性，并且耦連物對(duì)骨腫瘤區(qū)域有較好的親和性。 2.耦聯(lián)物對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用；耦聯(lián)物對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，隨著耦聯(lián)物濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)MG-63細(xì)胞的凋亡率逐