環(huán)磷酰胺調(diào)控Treg基礎(chǔ)上聯(lián)合新生血管干預(yù)的抗瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　觀察節(jié)律式應(yīng)用低劑量環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）調(diào)控Treg的基礎(chǔ)上聯(lián)合新生血管干預(yù)治療對(duì)小鼠肝癌的抗瘤效果，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法:
　　1、C57BL/6J小鼠荷瘤模型建立后第7天，以25mg/kg到200mg/kg不同的劑量對(duì)小鼠行腹腔注射CTX，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟組織中CD4+CD25+FOXP3+/Treg的比值，篩選出CTX的最佳劑量;
　　2、比

2、較單次和節(jié)律式應(yīng)用CTX對(duì)小鼠脾臟組織中Treg的影響:各組小鼠荷瘤后7d、11d、14d、18d、21d、25d、28d，每時(shí)間點(diǎn)每組各6只，頸椎脫臼法處死小鼠留取脾臟組織，檢測(cè)其CD4+CD25+FOXP3+/Treg比值，同時(shí)觀測(cè)小鼠腫瘤的大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)T-淋巴細(xì)胞干擾素-γ(IFN-γ)的分泌量來(lái)觀察對(duì)自身免疫病的影響;
　　3、新生血管干預(yù)治療聯(lián)合節(jié)律式低劑量應(yīng)用CTX對(duì)小鼠肝癌的抗瘤效果:

3、建立C57BL/6J小鼠皮下腫瘤模型，待腫瘤長(zhǎng)至100-150mm2體積大小時(shí)備用，分為4組，第一組為對(duì)照組:7d、14d、21d腹腔注射PBS(100mg/kg);第二組為單純CTX組，7d、14d、21d腹腔注射CTX(100mg/kg);第三組為單純BV組，4d、7d、11d、14d、18d、21d腹腔注射BV(5mg/kg);第四組為BV+CTX聯(lián)合治療組，4d、7d、11d、14d、18d、21d腹腔注射BV(5mg/kg)，

4、7d、14d、21d腹腔注射CTX(100mg/kg)，治療結(jié)束后制備脾臟淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞量，分析新生血管干預(yù)聯(lián)合節(jié)律式應(yīng)用低劑量CTX對(duì)腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+FOXP3+Treg的影響。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和小鼠生存期。采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清IFN-γ水平。
　　結(jié)果:
　　1、隨著荷瘤時(shí)間的延長(zhǎng)，荷瘤鼠脾臟組織中CD4+CD25+FOXP3+Tre

5、g的比值逐漸升高，至荷瘤后14d明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2、當(dāng)CTX的劑量為100mg/kg時(shí)，荷瘤鼠脾臟組織中CD4+CD25+FOXP3+/Treg比值明顯降低(P＜0.05)。
　　3、單次應(yīng)用CTX抑制Treg的時(shí)間較短，而節(jié)律式應(yīng)用低劑量CTX能夠延長(zhǎng)對(duì)Treg的抑制作用(P＜0.05)，維持其在相對(duì)降低的水平(P＜0.05)。
　　4、節(jié)律式應(yīng)用CTX顯著提高了荷瘤鼠脾臟T淋巴細(xì)胞IFN-γ的

6、分泌水平(P＜0.05)。
　　5、CTX組和對(duì)照組相比腫瘤生長(zhǎng)無(wú)明顯減緩，BV組和CTX+BV組的腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組相比均顯著減緩(P＜0.05)。生存分析顯示，BV組生存期有了顯著改善，同BV組相比，BV+CTX組生存期亦有顯著提高，表明BV和節(jié)律式CTX聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)BV的抗瘤效果。BV+CTX聯(lián)合治療組有2只小鼠瘤體逐漸減小并消退，小鼠長(zhǎng)期存活，且無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)。
　　6、應(yīng)用BV單藥治療或者聯(lián)合CTX治療小鼠脾臟的Tr

7、eg水平分別為7.17±2.18，5.07±1.47，均明顯低于對(duì)照組、單藥CTX組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。聯(lián)合治療組高于單純BV組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。BV+CTX組小鼠的血清IFN-γ水平均明顯高于其他各組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　7、應(yīng)用CTX的各治療組中均未出現(xiàn)免疫性白斑等自身免疫病及明顯毒副作用。
　　結(jié)論:
　　1、隨著腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)展，荷瘤小鼠脾臟組織中T

8、reg比例逐漸升高。
　　2、對(duì)于C57BL/6J荷瘤小鼠，CTX清除Treg的最佳劑量為100mg/kg。
　　3、單次應(yīng)用CTX抑制Treg的時(shí)間較短，而以最佳劑量，每周一次，節(jié)律式應(yīng)用CTX能夠使Treg在較長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)維持在相對(duì)較低的水平，節(jié)律式應(yīng)用CTX可能更具有使用價(jià)值。
　　4、與單純BV組、CTX組相比，BV+CTX治療組取得了最佳的抑瘤效果，荷瘤小鼠的存活期明顯延長(zhǎng)，生存率明顯提高，血清IFN-γ水平