轉(zhuǎn)染GDF-5的BMSC自體移植與應(yīng)用GAM對(duì)延緩椎間盤退變療效的比較.pdf

1、目的：
　　 腰椎間盤突出癥是骨科的常見病和多發(fā)病,也是腰腿痛的主要因?yàn)?嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量,并且丟失大量的社會(huì)勞動(dòng)力,給社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。一般認(rèn)為椎間盤突出是在椎間盤退變的基礎(chǔ)上發(fā)生的,其共同特征是髓核內(nèi)蛋白多糖含量的減少,因此可以通過生長因子刺激髓核細(xì)胞增加蛋白多糖的合成,減少分解來緩解甚至逆轉(zhuǎn)退變的過程。
　　 隨著基因強(qiáng)化組織工程學(xué)的發(fā)展,對(duì)椎間盤退變進(jìn)行分子水平上的治療成為可能,本實(shí)驗(yàn)通過采用基因治療的

2、兩種方法:干細(xì)胞體外基因修飾和直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染椎間盤細(xì)胞,使其在髓核組織內(nèi)持續(xù)表達(dá)GDF-5,來對(duì)延緩椎間盤退變的效果進(jìn)行比較,以期為臨床應(yīng)用基因療法治療椎間盤退變提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 (一)經(jīng)超順磁性氧化鐵標(biāo)記的自體BMSCs在兔椎間盤內(nèi)存活時(shí)間的研究
　　 1、兔BMSCs分離培養(yǎng)及檢測(cè)
　　 采用密度梯度離心法,分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增,并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色觀察

3、。
　　 2、SPIO標(biāo)記兔BMSCs及檢測(cè)
　　 取第三代原代培養(yǎng)細(xì)胞,采用SPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞普魯士藍(lán)鐵染色、透射電鏡檢測(cè)是否標(biāo)記成功,MTT法測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞增殖是否受到影響。
　　 3、標(biāo)記細(xì)胞在椎間盤內(nèi)存活時(shí)間的研究
　　 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別注入經(jīng)SPIO標(biāo)記和未標(biāo)記的BMSCs懸液,術(shù)后2、4、6、8周,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分另0取相應(yīng)椎間盤行普魯士藍(lán)鐵染色,鏡下觀察在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是否

4、出現(xiàn)藍(lán)染顆粒。
　　 (二)體內(nèi)體外兩種轉(zhuǎn)染方法對(duì)延緩椎間盤退變效果的比較研究
　　 1、脂質(zhì)體介導(dǎo)的pcDNA3.1(+)/GDF-5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況和形態(tài)學(xué)變化。
　　 2、基因活化基質(zhì)的制備
　　 Ⅰ型膠原支架切成直徑1mm長5mm的長條經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后備用,按步驟2的比列稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體,將支架放入其中浸泡30min后進(jìn)行動(dòng)物手術(shù)。
　　 3、動(dòng)物手術(shù)后2

5、個(gè)月椎間盤退變修復(fù)效果檢測(cè)
　　 取術(shù)后2個(gè)月各組兔椎間盤的髓核,間苯三酚法測(cè)蛋白多糖含量,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 (一)兔BMSCs其自體椎間盤中可以持續(xù)存活8周
　　 1、剛接種BMSCs的培養(yǎng)瓶中為大量圓形細(xì)胞,2～3 d出現(xiàn)少數(shù)長梭形細(xì)胞；5～7 d后圓形細(xì)胞消失,長梭形細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,成簇生長,呈放射狀排列；10～20 d開始呈對(duì)數(shù)生長。傳至第3代時(shí)細(xì)胞呈漩渦樣生長,掃描電

6、鏡顯示第3代細(xì)胞表面有大量微絨毛,糖原染色呈強(qiáng)陽性,Col Ⅰ、ALP及脂肪染色均呈陰性。
　　 2、經(jīng)普魯士藍(lán)鐵染色顯示陽性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)染顆粒,透射電鏡觀察顯示胞質(zhì)內(nèi)有電子高密度鐵顆粒,MTT檢測(cè)顯示7 d內(nèi)未標(biāo)記細(xì)胞組和SPIO標(biāo)記細(xì)胞組間細(xì)胞增殖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、術(shù)后2周,實(shí)驗(yàn)組鏡下可見髓核中有大量藍(lán)染顆粒,且位于胞質(zhì)內(nèi)；4周,髓核和纖維環(huán)均可見到位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的藍(lán)染顆粒；6、8周,仍可觀見位于胞

7、質(zhì)內(nèi)的藍(lán)染顆粒。各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組椎間盤切片均未觀察到藍(lán)染顆粒。
　　 (二)體內(nèi)體外兩種轉(zhuǎn)染方法對(duì)延緩椎間盤退變效果的比較研究
　　 1、轉(zhuǎn)染12小時(shí)后可見部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,48小時(shí)后細(xì)胞生長良好,體積略增大。
　　 2、轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組細(xì)胞以及手術(shù)后2個(gè)月各組椎間盤RTPCR結(jié)果如圖,pcDNA3.1(+)/GDF-5轉(zhuǎn)染細(xì)胞組,回輸轉(zhuǎn)染MSC組和GAM組的髓核均在約560bp處有電泳條帶,轉(zhuǎn)染成功。