Sca-1，CD24和Muc1在大鼠乳腺發(fā)育期分布的研究.pdf

1、背景和目的 哺乳動(dòng)物的乳腺是一種復(fù)管泡狀腺，具有分泌乳汁的功能；是動(dòng)物出生后唯一可以多次重復(fù)再生的器官。根據(jù)乳腺發(fā)育的特征，嚙齒類(lèi)動(dòng)物乳腺大致可以分為六個(gè)發(fā)育期：胚胎期、青春期、性成熟期、孕期、哺乳期和退化期。 在乳腺細(xì)胞分化過(guò)程中，往往由于高度分化而完全失去再生能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞的衰老死亡；乳腺在發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中為了補(bǔ)償這一不足，保留了一部分未分化的原始細(xì)胞，稱為乳腺干細(xì)胞。 乳腺細(xì)胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)

2、育及泌乳全過(guò)程，人們?cè)诩?xì)胞水平上進(jìn)行了大量的乳腺上皮細(xì)胞增殖及分化的研究。這些研究揭示乳腺干細(xì)胞再生乳腺和分化異常導(dǎo)致乳腺癌變的機(jī)制，為乳腺腫瘤和癌癥預(yù)防及治療提供理論依據(jù)，為研究器官形成和細(xì)胞分化機(jī)理提供合適的模型。 乳腺干細(xì)胞研究的標(biāo)記蛋白主要有CK5，Sca-1，α6-integrin，MUC<'->/ESA<'+>以及CK19。 合適的乳腺干細(xì)胞特殊標(biāo)記物的討論仍在進(jìn)行。在各報(bào)道中所確定的鑒別乳腺干細(xì)胞的標(biāo)記物不

3、同，這是值得重視和進(jìn)一步研究的現(xiàn)象。這種不同可能有多方面的原因：1．材料的來(lái)源不同；2．體內(nèi)和體外培養(yǎng)研究方法的不同；3．乳腺干細(xì)胞及其微環(huán)境隨著個(gè)體的發(fā)育也處于發(fā)育變化過(guò)程中；4．乳腺干細(xì)胞在建立復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和特殊功能過(guò)程中表達(dá)一系列相關(guān)的蛋白。我們選取青春期、性成熟期、孕期、哺乳期的大鼠乳腺組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，運(yùn)用免疫熒光和免疫酶標(biāo)記以及Western免疫印跡法，觀察Sca-1，CD24，Mucl在大鼠乳腺發(fā)育四個(gè)特

4、殊時(shí)期的表達(dá)，研究這三種細(xì)胞標(biāo)記物的分布，以探討乳腺干細(xì)胞的增殖和分化。 方法 1．乳腺組織石蠟切片的準(zhǔn)備：6 w(體質(zhì)量180～220g)、9 w(體質(zhì)量210～230g)、孕15 d(體質(zhì)量350～380g)、產(chǎn)后3 d(體質(zhì)量330～350g)，每個(gè)時(shí)期1組，每組12只，乳腺組織塊大小為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，制成4μm厚切片。 2．HE染色：研究乳腺發(fā)育四個(gè)時(shí)期的形態(tài)和小亮細(xì)胞的形態(tài)分布

5、。 3．免疫組化酶標(biāo)記：研究Sca-1，CD24和Muc1在乳腺發(fā)育四個(gè)時(shí)期的抗原陽(yáng)性情況。 4．免疫熒光單標(biāo)記：研究Sca-1，CD24，Muc1在乳腺發(fā)育四個(gè)時(shí)期的抗原陽(yáng)性情況。 5．Western免疫印跡法：取6 w、9 w、孕15 d、產(chǎn)后3 d的SPF級(jí)雌性大鼠，每個(gè)時(shí)期1組，每組3只，檢測(cè)Sca-1，CD24，Muc1在乳腺發(fā)育四個(gè)時(shí)期的各自含量。 6．免疫熒光雙標(biāo)記：Sea-1分別和CD24

6、以及Muc1標(biāo)記，觀察它們?cè)谒膫€(gè)時(shí)期的雙陽(yáng)性情況。 結(jié)果 1．HE染色結(jié)果6 w雌性大鼠乳腺末端主要是端芽結(jié)構(gòu)；9 w雌性大鼠乳腺主要是腺小葉。 在孕15 d乳腺組織中，乳腺的中、次級(jí)導(dǎo)管分支大量增加，腺泡迅速發(fā)育且數(shù)量增多。在產(chǎn)后3 d的乳腺組織中，乳腺小葉充滿分泌腺泡，腺泡上皮的形態(tài)多樣，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多空泡，在細(xì)胞核與細(xì)胞的游離面之間的胞質(zhì)中空泡特別多，小葉內(nèi)導(dǎo)管明顯可見(jiàn)，結(jié)締組織中的血管較多，小葉間隔很薄。

7、在6 w乳腺組織中，小亮細(xì)胞大多是數(shù)個(gè)或成群地分布，常位于乳腺分支導(dǎo)管及末端芽的基底部；在9 w乳腺組織中，小亮細(xì)胞分布于導(dǎo)管及腺泡的基底膜上，也部分位于肌上皮與腺上皮細(xì)胞之間；在孕15 d乳腺組織中，小亮細(xì)胞分布于小葉導(dǎo)管中；在產(chǎn)后3 d乳腺組織中，小亮細(xì)胞大多分布在分支導(dǎo)管中。 2．免疫組化酶標(biāo)記結(jié)果Sca-1<'+>細(xì)胞分別位于6 w雌性大鼠乳腺的脂肪細(xì)胞之間和腺泡周?chē)? w雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞之間和腺泡周?chē)?；?5 d

8、雌性大鼠乳腺脂肪墊的脂肪細(xì)胞之間表達(dá)：以及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺的脂肪細(xì)胞之間，輸乳管和乳腺脂肪墊中。 CD24<'+>細(xì)胞分別位于6 w雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞之間；9 w雌性大鼠乳腺脂肪墊中；在孕15 d雌性大鼠乳腺腺泡周?chē)?；在產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺的葉間導(dǎo)管。 Mucl<'+>細(xì)胞分別位于6w雌性大鼠乳腺的脂肪細(xì)胞之間，孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪墊中；以及在產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺葉間導(dǎo)管。 3．免疫熒光單標(biāo)記結(jié)

9、果9 w雌性大鼠葉間導(dǎo)管分別有Sea-1<'+>；CD24<'+>和Muc1<'+>細(xì)胞；產(chǎn)后3 d雌性大鼠母鼠乳腺分支導(dǎo)管分別有Sea-1<'+>；CD24<'+>和Muc1<'+>細(xì)胞。 4．Western免疫印跡法結(jié)果Sca-1在6 w和9 w乳腺中的含量沒(méi)太大變化，產(chǎn)后3 d大鼠乳腺的Sca-1含量比孕15 d的少，活動(dòng)期間的2個(gè)乳腺發(fā)育時(shí)期的Sca-1含量比靜止期的含量少。CD24在大鼠乳腺發(fā)育前6 w,9 w和孕15

10、 d三個(gè)時(shí)期含量沒(méi)太大變化，而在產(chǎn)后3 d大鼠乳腺CD24含量變少。Mucl在乳腺發(fā)育活動(dòng)期的2個(gè)時(shí)期含量比靜止期的2個(gè)時(shí)期高。 5．免疫免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果6 w雌性大鼠乳腺脂肪墊；9 w雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞間；孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞間；以及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞間均發(fā)現(xiàn)有Sca-1和CD24雙陽(yáng)性細(xì)胞。 6 w雌性大鼠乳腺腺泡周?chē)头种?dǎo)管；9 w雌性大鼠乳腺腺泡周?chē)?；?5d雌性大鼠乳腺脂肪細(xì)胞之間以

11、及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺分支導(dǎo)管存在Muc1和Sca-1雙陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論 1．活動(dòng)期的乳腺上皮細(xì)胞在乳導(dǎo)管基質(zhì)中廣泛增殖，乳腺中、次級(jí)導(dǎo)管分支增加；腺泡迅速發(fā)育，數(shù)量增多且胞體變大。與靜止期乳腺相比，這些明顯變化應(yīng)該是懷孕期間多種激素的作用結(jié)果；4個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)增殖部位都出現(xiàn)小亮細(xì)胞。 2．部分Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞可能代表一類(lèi)腔祖上皮細(xì)胞，而且在不同時(shí)期含量是有變化的。 3．關(guān)于乳腺干細(xì)胞的表面標(biāo)志物在乳腺

12、發(fā)育過(guò)程中可能有變化：(1)標(biāo)志物性質(zhì)的變化，即有不同標(biāo)志物的保留或更替；(2)標(biāo)志物表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD24在前三個(gè)時(shí)期含量沒(méi)變化，在產(chǎn)后3 d發(fā)生變化可能是對(duì)稱分裂發(fā)生的比較多，也可能是細(xì)胞橫向分化，使得這個(gè)時(shí)期干細(xì)胞含量降低。 4．Mucl在分泌乳汁的腺泡周?chē)蛯?dǎo)管內(nèi)側(cè)以及脂肪等多個(gè)部位表達(dá)，Mucl在乳腺發(fā)育活動(dòng)期的2個(gè)時(shí)期含量比靜止期含量高，它可能是成熟腔上皮細(xì)胞的標(biāo)志。 5．在乳腺發(fā)育時(shí)期，乳腺細(xì)胞