AURKA在CD24表型乳腺癌干細(xì)胞發(fā)展、EMT和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、目的：及內(nèi)容：
　　 腫瘤組織中有一種在數(shù)量上占少數(shù)的干細(xì)胞樣細(xì)胞，它具有無限的增殖能力和分化潛能，是腫瘤形成的起始細(xì)胞（CSCs）。CD24低表達(dá)或陰性表達(dá)細(xì)胞群被認(rèn)為屬于乳腺CSCs，乳腺CSCs與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）之間存在著一定的聯(lián)系。AURKA是一種癌基因，通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。AURKA蛋白也是一種中心體相關(guān)激酶，過表達(dá)導(dǎo)致中心體擴(kuò)增、紡錘體形成異常和基因組不穩(wěn)定性，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。腫瘤細(xì)

2、胞中只有少數(shù)CSCs決定腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和播散，因此AURKA和CSCs均與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但AURKA與乳腺CSCs、EMT的關(guān)系及導(dǎo)致乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤的機(jī)制目前國內(nèi)外尚未見報(bào)告。
　　 方法：
　　 建立裸鼠移植瘤模型，將2X106細(xì)胞注射到4周齡非卵巢切除的雌性NCR/Nu/Nu裸鼠側(cè)腹部皮下。IVS影像系統(tǒng)用來檢測腫瘤的定位和生長。數(shù)顯游標(biāo)卡尺每星期用來測量腫瘤體積。12周后處死裸鼠，建立原代培養(yǎng)細(xì)胞和給予不

3、同的處理。腫瘤在裸鼠體內(nèi)生長8周后通過尾靜脈注射的方法給予shRNA AURKA慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)粒子，一周2次，連續(xù)4周。采用MCF-7、MCF-71GX、MCF-7RAF-1、MCF-7RAF-11GX、shRNA MCF-7RAF-11GX細(xì)胞系進(jìn)行免疫熒光單標(biāo)記和雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測中心體表型、EMT表型、AURKA蛋白、Smad家族蛋白、THBS1、PCDH8和激素受體的表達(dá)。采用流式細(xì)胞術(shù)熒光染料碘化

4、丙啶進(jìn)行細(xì)胞周期分析，ModFit軟件分析所得數(shù)據(jù)。采用流式細(xì)胞術(shù)直接免疫熒光標(biāo)記法分析CD24的表型及陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的分選。TRIzo1法提取細(xì)胞總RNA，采用Affymetrix基因芯片技術(shù)分析基因轉(zhuǎn)錄組譜。
　　 結(jié)果：
　　 1.與MCF-7細(xì)胞相比較，MCF-7RAF-1細(xì)胞呈梭形，MAPK信號(hào)通路活化，但其中心體表型檢測、EMT和CD24表型均無顯著改變。傳統(tǒng)化療藥正定霉素（DR）處理可使其細(xì)胞周期檢查點(diǎn)

5、蛋白上調(diào)。雌二醇處理后，34％的MCF-7RAF-1細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制周期，明顯少于MCF-7細(xì)胞（58％）。同時(shí)給予雌二醇和三苯氧胺處理，MCF-7細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由58％下降到了15％，而MCF-7RAF-1細(xì)胞則由34％下降到24％。
　　 2. MCF-7RAF-1裸鼠異種移植瘤顯示了明顯高于MCF-7腫瘤的生長速度，原發(fā)瘤組織呈現(xiàn)組織學(xué)更高級別的腫瘤及中心體擴(kuò)增的表型，激素受體檢測ERa（+），但PR（-），HER2/

6、neu（+），接種瘤的裸鼠肺組織中出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移。MCF-7RAF-1原發(fā)瘤原代培養(yǎng)產(chǎn)生的MCF-7RAF-11GX細(xì)胞中，AURKA蛋白出現(xiàn)了顯著的高表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白Cyclins如D1、E和A并未顯示高表達(dá)，但CyelinB、CDC25A和Claspin則顯示了高表達(dá)?；蛐酒治鲲@示了MCF-7RAF-11GX中MAPK信號(hào)通路和TGFB/Smad信號(hào)通路中的相關(guān)因子的表達(dá)出現(xiàn)異常。
　　 3.MCF-7RAF-1

7、1GX的CD24陰性細(xì)胞所占百分比為34％，顯著高于其來源的母系細(xì)胞系。CD24陰性細(xì)胞群中心體表型出現(xiàn)了擴(kuò)增，AURKA出現(xiàn)了過表達(dá)，發(fā)展了EMT特征，Wnt6、Smad家族、THBS1、PCDH8表達(dá)出現(xiàn)了異常，ERa表達(dá)下降而HER-2表達(dá)增加。
　　 4.AURKA抑制劑能夠使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，顯著降低AURKA蛋白的表達(dá)。重要的是，AURKA抑制劑MLN8237只在MCF-7RAF-11GX細(xì)胞系誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡

8、標(biāo)記物cleaved PARP的表達(dá)。同時(shí)CD24陽性細(xì)胞百分率增加，由對照組的60％增加到85％（處理48小時(shí)）和94％（處理72小時(shí)）。
　　 5.給予CD24陰性細(xì)胞群AURKA抑制劑也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但DR不能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，此外AURKA還可使CD24陰性細(xì)胞群上皮標(biāo)記物E-cadherin、β-catenin重新獲得表達(dá)，而間質(zhì)標(biāo)記物vimentin表達(dá)顯著下降，smad家族蛋白表達(dá)下調(diào)，THBS1和PCDH8表達(dá)

9、恢復(fù)。shRNAAURKA處理的裸鼠顯示了明顯的腫瘤體積縮小，AURKA蛋白表達(dá)下降，中心體擴(kuò)增的表型受到抑制，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。shRNA MCF-7RAF-11GX細(xì)胞CD24陰性表達(dá)率只有15.4％，EMT表型、smad家族、THBS1、PCDH8表達(dá)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 RAF-1基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的MAPK信號(hào)通路活化經(jīng)過裸鼠模型體內(nèi)的生長使AURKA基因轉(zhuǎn)錄增加從而使蛋白過表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞對AURKA存在“

10、癌基因嗜性”，AURKA高表達(dá)細(xì)胞顯示了中心體的擴(kuò)增，并經(jīng)過體內(nèi)生長發(fā)展了分化更差、組織學(xué)分級更高的腫瘤。MCF-7RAF-1經(jīng)過裸鼠模型體內(nèi)的生長誘發(fā)了多條信號(hào)通路和蛋白表達(dá)的異常，其中Wnt信號(hào)通路、Smad家族、THBS1蛋白和PCDH8蛋白的異常與AURKA高表達(dá)有關(guān)。AURKA可驅(qū)動(dòng)CD24陰性細(xì)胞群的發(fā)展，即乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量的增加，而且還誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生并引起乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。抑制AURKA蛋白的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞C