玫瑰花香成分生物合成相關(guān)基因RrNUDX1和RrDXR的功能驗(yàn)證研究.pdf

1、玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是世界上重要的天然香料植物，也是我國傳統(tǒng)的藥食同源花卉，單萜類化合物中的香茅醇、香葉醇、橙花醇及其乙酸酯類衍生物是玫瑰鮮花及其精油的主要香氣成分。采用基因工程和代謝工程手段，調(diào)控玫瑰單萜類化合物的生物合成途徑，促進(jìn)下游代謝產(chǎn)物的積累，進(jìn)而創(chuàng)制精油含量提高的玫瑰新種質(zhì)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分離單萜代謝相關(guān)的基因，克隆相關(guān)基因的啟動(dòng)子，開展酵母單雜交篩選;

2、并以矮牽牛為試材，開展玫瑰主要花香成分生物合成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證研究，旨在挖掘調(diào)控玫瑰花香代謝的關(guān)鍵基因，為接下來創(chuàng)制高精油含量的玫瑰新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以玫瑰主栽品種‘唐紅’盛開期花瓣為試材，采用RACE法克隆獲得了玫瑰Nudix水解酶基因家族成員RrNUDX1的全長cDNA序列，該cDNA全長777bp，具有完整的開放閱讀框，共編碼151個(gè)氨基酸，基因登陸號為KX096710.1。結(jié)合‘唐紅’不同花發(fā)育

3、時(shí)期和花器官不同部位香氣成分的測定，我們發(fā)現(xiàn)，RrNUDX1基因表達(dá)水平的變化與玫瑰主要芳香成分含量的變化趨勢一致，均先升高后降低。隨著花朵開放進(jìn)程的推進(jìn)，RrNUDX1基因的表達(dá)水平逐步上升，且主要芳香成分的含量也隨之上升，除香茅醇及乙酸香茅酯的含量在半開期達(dá)到最高外，其他4種成分均在盛開期含量達(dá)到最高。從部位上看，玫瑰香氣物質(zhì)主要集中在花瓣、雄蕊、雌蕊中，其他部位含量極低，與RrNUDX1基因在花器官不同部位的表達(dá)規(guī)律一致。這表明R

4、rNUDX1基因與玫瑰主要單萜類芳香成分的生物合成密切相關(guān)。
　　2.以‘唐紅’半開至盛開期的花瓣為試材，采用invitrogen系統(tǒng)，構(gòu)建了玫瑰三框讀碼酵母單雜交文庫，結(jié)果表明，庫容量大于1×107CFU，質(zhì)粒空載率小于5％，平均插入片段長度大于1.2Kbp，符合酵母文庫的篩選要求，為下一步通過建立誘餌載體進(jìn)行單雜交篩選，尋找玫瑰花香代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)。
　　3.采用染色體步移技術(shù)，分別克隆獲得了玫瑰RrNUDX1

5、和RrDXR基因的啟動(dòng)子序列，結(jié)果表明，RrNUDX1基因共獲得617 bp的啟動(dòng)子序列，預(yù)測發(fā)現(xiàn)其中與花香代謝有關(guān)的元件2個(gè)，分別為MYB的核心元件MBS(N1 TAACTG)和茉莉酸核心元件(N2TGACG)。RrDXR基因共獲得2213 bp的啟動(dòng)子序列，預(yù)測發(fā)現(xiàn)其中與花香代謝有關(guān)的元件3個(gè):MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)(D1 CAACGG)和花特異苯丙烷類花香形成重要順式作用原件(D2 GACCAACC，D3 AACCTACT)。將預(yù)測

6、的5個(gè)順式作用元件分別構(gòu)建在報(bào)告基因的啟動(dòng)子之前，進(jìn)行酵母單雜交篩選，發(fā)現(xiàn)這些元件與RrNUDX1和RrDXR不存在互作，無法進(jìn)一步篩選出調(diào)控順式作用元件的轉(zhuǎn)錄因子，后續(xù)研究需進(jìn)一步擴(kuò)大預(yù)測片段的篩選量，從而獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。
　　4.進(jìn)一步構(gòu)建RrNUDX1基因的過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCAMBIA1304-RrNUDX1和pCAMBIA1304-RrDXR過表達(dá)載體導(dǎo)入矮牽牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)RrNUDX1基因的矮牽牛植