丹參酚酸類成分生源途徑的探索及相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是我國傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以迷迭香酸(RA)和丹酚酸B(SAB)為代表的水溶性酚酸類成分被認為是丹參發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)基礎(chǔ)的重要部分，逐漸受到研究人員的關(guān)注。但目前對于丹參水溶性酚酸類生源途徑的研究還剛剛起步，尤其是丹參中標(biāo)志性酚酸類成分丹酚酸B的代謝途徑還未見相關(guān)報道。同時對于丹參中已有報道的另一標(biāo)志性成分迷迭香酸的生源途徑研究還不夠全面，其下游

2、的關(guān)鍵酶基因SmRAS，SmCYP98A14并未有相關(guān)研究。因此針對這些問題的研究對于丹參中酚酸類資源的開發(fā)利用具有重要意義。
　　 本研究利用13C同位素標(biāo)記前體飼喂的方法，對丹參酚酸類化合物尤其是丹酚酸B的生源途徑進行了探索，并利用動態(tài)監(jiān)測的方法對已報道的迷迭香酸的生源途徑進行了重新評價。同時，克隆得到了酚酸類生源途徑上的3個重要基因SmRAS、SmCYP98A14，SmCPR，并對這3個基因的功能進行了研究。我們得到了如下

3、結(jié)果：
　　 1、首次通過同位素標(biāo)記提出了迷迭香酸到丹參酚酸B可能的生物合成過程，兩分子迷迭香酸經(jīng)過催化生成丹酚酸E，丹酚酸E環(huán)合生成丹酚酸B。這是首次對丹參酚酸B的生源途徑進行探索，為解決丹參酚酸類化合物生物合成的這一重要問題提供了有價值的信息。
　　 2、利用同位素標(biāo)記動態(tài)監(jiān)測的方法對迷迭香酸生源途徑進行了重新評估。結(jié)果顯示，丹參中迷迭香酸生物合成的主要以咖啡酰CoA和4-羥基苯乳酸生成咖啡酰-4-羥基本乳酸，而后在

4、SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸為主，而非之前報道的4-香豆酰CoA與4-羥基苯乳酸反應(yīng)生成4-香豆酰-3-4-羥基苯乳酸，而后在SmCYP98A14的催化下生成迷迭香酸。這個結(jié)論改變了我們之前對迷迭香酸生物合成過程的認識，對重新認識迷迭香酸生物合成有重要價值。
　　 3、在以上研究基礎(chǔ)上，首次將迷迭香酸與丹酚酸B的生物合成的過程聯(lián)系到一起，描述了從苯丙氨酸和酪氨酸開始經(jīng)迷迭香酸最終生成丹酚酸B的整個過程，極大拓展了丹參

5、酚酸類化合物的生源途徑，幫助人們重新認識酚酸類化合物的生物合成過程。
　　 4、克隆得到了丹參酚酸類生源途徑上的關(guān)鍵酶基因SmRAS(GenbankaccessionNo.ADA60182)包含1489bp堿基，其中包括1284bp的開放閱讀框(ORF)編碼428個氨基酸、SmCYP98A14(GenbankaccessionNo.HQ316179)包含1714bp堿基，其中包括1527bp的開放閱讀框(ORF)編碼508個氨基

6、酸、SmCPR(GenbankaccessionNo.FR693803)，包含2771bp堿基，其中包括2118bp的開放閱讀框(ORF)編碼705個氨基酸。
　　 5、考察了這三個基因在不同組織器官中的表達水平及誘導(dǎo)表的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個基因在根莖葉中均有表達，SmRAS在莖中表達最高、SmCYP98A14在根中表達最高、SmCPR在葉中表達最高。誘導(dǎo)表達研究表明，這三個基因均能被甲基茉莉酸(MeJA)及脫落酸(ABA)誘導(dǎo)

7、表達上調(diào)。
　　 6、通過RNAi干擾研究驗證了SmRAS及SmCYP98A14基因在酚酸類生物合成過程中的功能。RNAi干擾SmRAS及SmCYP98A14能夠明顯降低丹參毛狀中迷迭香酸和丹酚酸B的含量。RNAi-SmRAS效果最顯著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量均低于CK的20％，RNAi-SmCYP98A14效果最顯著株系中迷迭香酸和丹酚酸B的含量為于CK的30％。對這兩個基因的RNAi均導(dǎo)致酚酸類合成途徑上其它基因表達明