GAD-65、GABA-,A-R、Glu、NMDAR-,1-蛋白在原發(fā)性顳葉癲癇灶的表達(dá)及癲癇灶線粒體、突觸的體視學(xué)分析.pdf

1、原發(fā)性顳葉癲癇(TLE)的特征是由于大腦顳葉神經(jīng)元發(fā)作性異常放電所引起的反復(fù)癲癇發(fā)作。根據(jù)臨床表現(xiàn)和腦電圖TLE可分類為：?jiǎn)渭儾糠中园l(fā)作(Sireple pattialseizures，SPS)、復(fù)雜部分性發(fā)作(Complex partial seizures，CPS)、部分性發(fā)作繼發(fā)全身發(fā)作(Produce generalized seizure，PGS)。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為癲癇發(fā)病是腦內(nèi)興奮．抑制失衡的結(jié)果，與腦內(nèi)抑制性神

2、經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸脫羧酶(GAD)及GABA<,A>R的減少和興奮性遞質(zhì)谷氨酸(Glu)及其N-甲基D-天冬氨酸(NMDAR<,1>)的增多有密切的關(guān)系。本研究取45例原發(fā)性TLE患者的棘波和棘慢波的腦組織。采用免疫組化方法檢測(cè)GAD-65、G1u、GABA<,A>R、NMDAR<,1>蛋白的表達(dá)。免疫電鏡方法觀察興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)所分布的突觸類型。體視學(xué)方法定量分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞線粒體的體積密度(Vv)、表面積密度(Sv)、數(shù)

3、密度(NV)、平均比表面積(6)、平均體積(V)和突觸數(shù)密度(SD)、突觸活性區(qū)膜面積(SAA)、突觸比表面積(SR)、突觸界面曲率(SIC)、突觸小泡數(shù)密度(SVD)。采用高效液相色譜儀測(cè)量癲癇灶線粒體腺苷酸含量和ATP生成率。測(cè)量術(shù)前、術(shù)中腦電圖出現(xiàn)在同一部位的棘波和棘慢復(fù)合波的數(shù)量。所得出的參數(shù)與8例(6例腦血管畸形和2例鞍旁腫瘤)手術(shù)切除正常腦組織測(cè)量參數(shù)進(jìn)行對(duì)照；并與癲癇患者的發(fā)病頻率和癲癇波的數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。主要的結(jié)果如

4、下： 1．光鏡觀察結(jié)果(1)SPS患者顳葉皮質(zhì)癇灶神經(jīng)元腫脹，體積增大，突起沒有明顯的變化；海馬CA<,1>區(qū)錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞腫脹，海馬細(xì)胞丟失不明顯。海馬硬化占40％。(2)CPS患者顳葉皮質(zhì)癇灶神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮、染色質(zhì)邊集、胞漿變性或腫脹呈空泡狀，出現(xiàn)細(xì)胞壞死，甚至丟失。海馬CA<,1>區(qū)錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞腫脹，部分缺失；CA<,3>區(qū)仍有大量細(xì)胞腫脹，但變性較少。 CA<,2>沒有明顯的變化。海馬硬化占57.89％

5、。(3)PGS患者顳葉皮質(zhì)癇灶神經(jīng)元胞體腫脹，核固縮、胞漿變性或腫脹呈空泡狀，出現(xiàn)大量的細(xì)胞壞死，甚至丟失。存活的顆粒細(xì)胞腫脹較輕，呈現(xiàn)軸突棘的延長，軸索發(fā)芽。膠質(zhì)細(xì)胞增生，尤以星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著。海馬硬化占68.75％． 對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)基本正常，略有腫脹，沒有明顯的細(xì)胞丟失，顆粒細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，未見腫脹和壞死。 2．免疫組織化學(xué)結(jié)果在三種不同發(fā)作類型中，Glu和NMDAR<,1>蛋白免疫反應(yīng)陽

6、性細(xì)胞在皮質(zhì)主要分布在顆粒細(xì)胞層和錐體細(xì)胞層，以錐體細(xì)胞和多角形細(xì)胞為主，均有很強(qiáng)的免疫陽性反應(yīng)；海馬免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要分布在CA<,3>區(qū)和齒狀回，海馬齒狀回顆粒細(xì)胞樹突有增生。相關(guān)性分析Glu和NMDAR<,1>蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)與患者發(fā)病頻率、腦電圖癲癇波數(shù)量呈正相關(guān)呈負(fù)相關(guān)。在CPS和PGS患者Glu和NMDAR<,1>免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞較SPS患者減少；海馬癇灶的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞大部分為顆粒細(xì)胞。PGS患者海馬顆粒細(xì)胞樹突

7、增生較SPS和CPS患者明顯，并有很多分枝，與苔狀纖維形成了直接的興奮性的回返性突觸聯(lián)系。而GAD-65和GABA<,A>R免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞在皮質(zhì)和海馬稀少，免疫陽性反應(yīng)弱；其相關(guān)發(fā)性分析與患者發(fā)病頻率呈負(fù)相關(guān)，與腦電圖癲癇波數(shù)量相關(guān)性不明顯。 3．超微結(jié)構(gòu)觀察癲癇灶內(nèi)神經(jīng)元在三種不同發(fā)作類型癇灶內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量少，腫脹變性，體積增大，基質(zhì)變淺。脂褐素沉積增多。PGS患者存活的神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，線粒體增生，出現(xiàn)軸索發(fā)芽，形成神經(jīng)氈。星

8、形膠質(zhì)細(xì)胞在三種不同發(fā)作類型中均有增生現(xiàn)象，但在CPS患者癇灶內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯。有髓神經(jīng)纖維在CPS和PGS患者中可見到髓鞘局灶性松解、脫失，部分髓鞘甚至出現(xiàn)缺口；軸索內(nèi)微管、微絲排列紊亂、扭曲。血腦屏障在CPS患者腦內(nèi)改變較為突出，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞水腫，基底膜增厚并彎曲，甚至分層或有沉積物。 4．免疫電鏡結(jié)果癲癇灶Glu的DAB反應(yīng)產(chǎn)物為塊狀沉淀，分布在非對(duì)稱性軸-樹、軸棘突觸內(nèi)和核周質(zhì)，偶見于核內(nèi)；GAD-65的DAB反應(yīng)產(chǎn)

9、物為顆粒狀沉淀，分布在對(duì)稱性軸-樹、軸棘突觸內(nèi)，核周質(zhì)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上、樹突微管軸突的小清亮囊泡周圍。 5．圖像定量分析 5．1線粒體體視學(xué)分析三種不同發(fā)作類型患者癇灶線粒體的Vv、Sv、V值大于對(duì)照組(P<0.05)，線粒體的Nv、δ值小于對(duì)照組(P<0.05)。相關(guān)性分析線粒體Vv、V與患者的發(fā)病頻率正相關(guān)；Nv、δ與患者的發(fā)病頻率呈負(fù)相關(guān)。 5.2突觸結(jié)構(gòu)定量分析在三種不同發(fā)作類型患者癇灶內(nèi)突觸的S

10、D、SAA、SR、SIC小于對(duì)照組(P<0.05)，相關(guān)性分析與患者的發(fā)病頻率、腦電圖癲癇波數(shù)量呈正相關(guān)；SVD值大于對(duì)照組(P<0.05)，相關(guān)性分析與患者的發(fā)病頻率、腦電圖癲癇波數(shù)量呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組軸棘、軸樹突間隙寬度明顯小于對(duì)照組(P<0.05)。三種不同發(fā)作類型突觸體視學(xué)參數(shù)與腦電圖癲癇波數(shù)量均呈正相關(guān)。 通過對(duì)以上結(jié)果的綜合分析，結(jié)合參考文獻(xiàn)，本研究尚得出以下結(jié)論： 1．癲癇的病理特征與癲癇的發(fā)病有關(guān)。SPS患

11、者癇灶內(nèi)神經(jīng)元主要表現(xiàn)為腫脹變性。CPS患者癇灶神經(jīng)元主要表現(xiàn)為變性、壞死、缺失和海馬CA<,1>區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的缺失。PGS患者神經(jīng)元主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變性，顆粒細(xì)胞突起延長。星形膠質(zhì)細(xì)胞在CPS和PGS患者癇灶內(nèi)增生明顯。 2．腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GAD-65、GABA<,A>R的減少和興奮性遞質(zhì)Glu、NMDAR<,1>的增多有密切的關(guān)系。其在癇灶內(nèi)分布和含量的不同可能與不同發(fā)作類型的臨床表現(xiàn)有關(guān)。 3．三種不同發(fā)作類