硒抗肽聚糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥損傷作用及其TLR2-NOD2信號通路的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛產(chǎn)后重要疾病之一，會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。乳腺炎不局限于細(xì)菌感染，其特征在于白細(xì)胞和血清蛋白從血液轉(zhuǎn)移到感染部位的運(yùn)動。硒是哺乳動物飲食中的必需營養(yǎng)物質(zhì)，具有一些抗炎性質(zhì)。硒以硒蛋白的形式存在于機(jī)體中，并主要通過其抗氧化作用參與到機(jī)體的免疫防御機(jī)制中。多項研究已證實，飼喂添加適量的硒的飼料，可以最大限度地降低動物群體中乳腺炎，白肌病以及呼吸系統(tǒng)方面的疾病的發(fā)病率。肽聚糖(PGN)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的主要成分，有研

2、究表明金葡菌的肽聚糖可以刺激宿主細(xì)胞上相關(guān)病原識別受體，激活炎癥信號通路。因此，本論文從分子學(xué)的角度研究了硒的抗炎作用以及硒對相關(guān)炎癥信號通路的影響，為乳腺炎未來的防控發(fā)展提供了理論依據(jù)。
　　金黃色葡萄球菌是臨床上奶牛乳腺炎最重要的致病菌之一，通過研究其一種致病因子來探索其致病機(jī)理以及機(jī)體對其反應(yīng)機(jī)制，這對奶牛乳腺炎的防治具有重要的現(xiàn)實意義。我們通過膠原酶完全消化法體外培養(yǎng)了一批奶牛乳腺上皮原代細(xì)胞，用PGN侵染細(xì)胞構(gòu)建了奶牛乳

3、腺上皮細(xì)胞(bMEC)炎癥模型，檢測在PGN刺激下其細(xì)胞因子表達(dá)的變化。實驗結(jié)果表明，乳腺上皮細(xì)胞在匯合之前呈典型的島嶼狀集落生長，匯合之后的細(xì)胞形態(tài)具有典型的鋪路石樣、導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的特點，一直培養(yǎng)下去會形成穹窿樣結(jié)構(gòu)。
　　為了探索硒濃度對奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響，我們選擇不同濃度(0、1、2、4、8、16、32和64μM)的硒處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞12h后，利用MTT法對活細(xì)胞特有的反應(yīng)檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，在0～16μM范

4、圍內(nèi)的硒濃度對細(xì)胞活性影響不大，16μM以上隨著硒濃度的增加，乳腺上皮細(xì)胞的存活率逐漸下降，且在32μM和64μM的硒濃度時細(xì)胞活性與對照組相比出現(xiàn)極顯著下降(p＜0.001)，這說明高濃度的硒對乳腺上皮細(xì)胞具有損傷作用。
　　為研究硒在PGN誘導(dǎo)的BMECs的炎癥反應(yīng)中對TLR2和Nod2信號通路的影響。不同濃度的硒(2、4和8μM)添加在培養(yǎng)液中，檢測硒對TLR2、Nod2/NF-κB、MAPK信號通路的影響。實驗結(jié)果表明，P

5、GN刺激后8h，10h，12h時，2、4和8μM的硒均能有效地抑制PGN誘導(dǎo)的bMECs TLR2通路上，TLR2，Myd88; Nod2通路上Rip2以及兩條通路的下游NF-κB，TNF-α，IL-1β，IL-6促炎因子的基因表達(dá)(p＜0.01或p＜0.001)。其中8h時，2和8μM的硒對Nod2沒有明顯的抑制作用。
　　我們采用We sternBlot技術(shù)從蛋白水平研究硒對炎癥信號通路的影響，尤其是對TLR2、Nod2/NF

6、-κB、MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。將bMECs分成5組，以不添加亞硒酸鈉和PGN的細(xì)胞作為空白對照組，以加PGN刺激0.5 h的細(xì)胞作為模型組，以添加不同濃度的亞硒酸鈉（2、4和8μM）預(yù)孵12h并用PGN刺激0.5 h的細(xì)胞作為加硒劑量組，分別檢測TLR2，Myd88; Nod2、Rip2、Card9;IκBα、p65; p38、JNK和Erk蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，PGN刺激乳腺上皮細(xì)胞0.5 h后TLR2、My

7、d88、Nod2、Rip2、Card9、IκBα、p65、p38、JNK和Erk蛋白的磷酸化水平與空白對照組相比極顯著上升(p＜0.001)。與模型組相比，4μM的硒能極顯著抑制PGN誘導(dǎo)的TLR2通路TLR2、Myd88的磷酸化;Nod2通路Rip2的磷酸化;NF-κB通路IBα、p65的磷酸化(p＜0.001)，同時極顯著降低了PGN誘導(dǎo)的MAPK通路p38、JNK和Erk的磷酸化(p＜0.001)。這些結(jié)果表明4μM的硒通過調(diào)節(jié)T