AMH與PCOS卵泡發(fā)育障礙機制探索及RNA干擾技術治療高雄激素血癥在體動物研究.pdf

1、第一部分 AMH與PCOS卵泡發(fā)育障礙治療靶點的初步研究
　　 目的：卵泡發(fā)育障礙是多囊卵巢綜合征(PCOS)最常見的臨床癥狀之一，由其所致的月經(jīng)稀發(fā)和不孕是PCOS患者就診的主要原因，由于PCOS長期不排卵造成子宮內(nèi)膜癌等遠期并發(fā)癥對女性生殖健康構成嚴重威脅。針對PCOS卵泡發(fā)育障礙機制尚未完全明確及促排卵治療低效高風險的現(xiàn)狀，本研究探討了PCOS顆粒細胞AMH啟動子活性與其過度分泌的關系，從新的角度揭示卵泡發(fā)育障礙的病因。并

2、通過研究FSH調(diào)節(jié)PCOS顆粒細胞AMH轉(zhuǎn)錄表達的分子通路，為今后治療PCOS卵泡發(fā)育障礙探索新的靶點。
　　 方法：本實驗共分為四組：PCOS顆粒細胞、IVM促排卵刺激PCOS顆粒細胞、添加外源性FSH刺激PCOS顆粒細胞、IVF對照顆粒細胞各15例。PCOS顆粒細胞組顆粒細胞在入組前3個月內(nèi)均未接受過任何促排卵藥物刺激或手術治療，PCOS患者的診斷標準為2003年制定的Rotterdam標準。PCOS+FSH組顆粒細胞也來源

3、于上一組未經(jīng)促排卵藥物刺激行卵泡穿刺術的PCOS患者。但是與前一組不同的是該組顆粒細胞在體外培養(yǎng)過程中添加了外源性的FSH(0.075IU/ml)。該組主要用于觀察外源性FSH對PCOS顆粒細胞AMH過度分泌的影響。IVMPCOS組顆粒細胞來源于經(jīng)內(nèi)源性FSH促排卵刺激后行卵泡穿刺術的PCOS患者，該組主要用于觀察內(nèi)源性FSH對PCOS顆粒細胞AMH過度分泌的影響。IVF對照組顆粒細胞來源于具有正常月經(jīng)周期因輸卵管因素不孕在本中心行IV

4、F-ET手術的不孕患者，患者均采用長方案進行控制性卵巢刺激。以上各組患者均在B超引導下采用20G取卵針經(jīng)陰道穿刺8-10mm大小的竇卵泡。在卵泡穿刺過程中采用加肝素的PBS緩沖液沖洗取卵針，收集所有沖洗液用于分離顆粒細胞。顆粒細胞的分離純化采用密度梯度離心法，之后將分離純化后的顆粒細胞體外培養(yǎng)48小時，并收集培養(yǎng)液和顆粒細胞進行相關分子生物學檢測。分別采用ELISA和qRT-PCR檢測AMH分泌水平及mRNA的表達豐度，同時采用qRT-

5、PCR和Western-lot比較各組顆粒細胞AMHRⅡ mRNA和蛋白的表達差異，構建hAMH-Juc雙熒光報道基因載體研究AMH啟動子活性及FGH對其活性的分子調(diào)控通路。
　　 結果：收集各組顆粒細胞培養(yǎng)液測定AMH分泌水平為：PCOS顆粒細胞組11.41±3.99ng/ml、PCOS顆粒細胞添加外源性FSH組7.91±1.09ng/m1、PCOSIVM顆粒細胞組5.62±1.71ng/ml、IVF對照顆粒細胞組4.78±0

6、.94ng/ml。收集顆粒細胞提取總RNA測定AMH mRNA的表達豐度，結果顯示PCOS顆粒細胞組AMH mRNA表達豐度顯著高于IVF對照組，添加外源性FSH或IVM方促排卵刺激均能夠抑制PCOS顆粒細胞AMH mRNA的轉(zhuǎn)錄表達，尤其以后者的抑制效果更顯著。PCOS顆粒細胞組AMHRⅡ mRNA的表達豐度顯著高于IVF對照組，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激對其表達無顯著影響。收集顆粒細胞提取總蛋白測定AMHRⅡ的蛋白表達水平，

7、其結果與mRNA表達一致。PCOS顆粒細胞組AMHRⅡ蛋白表達水平顯著高于IVF對照組，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激對其表達無顯著影響。構建hAMH-luc載體檢測PCOS顆粒細胞AMH啟動子活性顯著高于對照組，而添加外源性FSH能夠顯著抑制AMH啟動子活性。
　　 結論：AMH啟動子活性異常增高所致的轉(zhuǎn)錄水平增加是導致PCOS顆粒細胞AMH過度分泌的重要原因。FSH能夠抑制PCOS顆粒細胞AMH啟動子活性和轉(zhuǎn)錄表達，削弱

8、其對卵泡生長發(fā)育的抑制作用從而達到促排卵的目的，但對AMHRⅡ的影響不大。本研究從新的角度解釋了FSH的促排卵機制，可能為PCOS卵泡發(fā)育障礙的治療提供新的靶點。
　　 第二部分LH升高和非升高型PCOS患者AMH分泌特點及卵泡發(fā)育障礙機制比較
　　 目的：多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的婦科疾病之一，由卵泡發(fā)育障礙所致的不孕、月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)是患者就診的主要原因[1-3]。由于臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性，先前就有學者

9、提出PCOS患者可以分為兩種類型，LH升高型和非升高型。這兩種亞型的患者都存在不同程度的排卵障礙，本研究比較這兩種亞型AMH的分泌特點及卵泡發(fā)育障礙的機制。
　　 方法：本研究共納入95名PCOS患者，患者的納入標準為2003制定的Rotterdam標準。根據(jù)LH/FSH比值將PCOS患者分為LH升高型(LH/FSH≥2)和非升高型(LH/FSH＜2)。其中LH升高型49例，LH非升高型46例。研究還納入62名具有正常月經(jīng)周期輸

10、卵管性不孕的患者作為對照組。所有研究對象均測定BMI指數(shù)，并采用ELISA和化學發(fā)光法測定血清中AMH、卵巢性激素、糖脂代謝生化指標及慢性炎癥因子的水平。采用單因素方差分析法比較各組間生化代謝指標的差異，采用簡單相關分析法和多重線性回歸分析法研究AMH與各生化代謝指標的關系。
　　 結果：LH非升高型PCOS患者的BMI、空腹胰島素、HOMA-IR、TG、TG/HDL水平均顯著高于LH升高型和對照組，而LH升高型PCOS患者的L

11、H、LH/FSH、T水平均顯著高于LH非升高型和對照組。通過比較各組AMH血清水平發(fā)現(xiàn)，LH升高型PCOS患者、LH非升高型PCOS患者及對照組患者血清AMH水平分別為7.23±4.34 ng/ml、5.23±3.76 ng/ml、3.74±2.25ng/ml。PCOS組患者血清AMH水平顯著高于對照組，且LH升高型高于非升高型。兩種亞型的PCOS患者AMH血清水平均顯著高于對照組，但是LH升高型PCOS患者的AMH血清水平又顯著高于L

12、H非升高型。此外，PCOS患者血清CRP和IL-6水平均顯著高于對照組，但兩種亞型之間并無統(tǒng)計學差異。
　　 采用Pearson相關法分析LH升高型PCOS患者AMH血清水平與各生化指標的關系，結果顯示LH升高型PCOS患者的AMH血清水平與E2呈負相關，相關系數(shù)為-0.318。LH非升高型PCOS患者的AMH血清水平與BMI、空腹血糖、HOMA-IR呈正相關，相關系數(shù)分別為0.493、0.362、0.303，與HDL呈負相關，

13、相關系數(shù)為-0.309。采用多重線性回歸法控制其它因素的影響后，LH升高型PCOS患者的AMH血清水平與LH/FSH呈正相關，與E2呈負相關，相關系數(shù)分別為0.301和-0.429。LH非升高型PCOS患者的血清AMH水平僅與BMI呈正相關，相關系數(shù)為0.49。
　　 結論：我們首次從AMH的角度揭示了LH升高型和非升高型卵泡發(fā)育障礙的機制可能存在差異，這將為PCOS患者個體化治療方案的制定提供依據(jù)。但是由于本研究僅為病例對照研

14、究，無法進一步分析AMH與各臨床生化指標的因果關系，因此還需要更大樣本的前瞻性研究來證實本研究的結論。
　　 第三部分 RNAi抑制高雄激素分泌治療PCOS卵泡發(fā)育障礙在體動物研究
　　 目的：17α羥化酶/17，20斷裂酶由CYP17基因編碼是雄激素代謝途徑中的限速酶。CYP17轉(zhuǎn)錄水平增加所致的17α羥化酶/17，20斷裂酶活性亢進是引起PCOS雄激素過度分泌的重要原因。本研究將CYP17基因選為治療的靶點，采用RN

15、A干擾技術沉默該基因在大鼠卵巢組織中的表達，部分抑制17α羥化酶/17，20斷裂酶的活性，從而抑制卵巢雄激素的過度分泌。
　　 方法：針對大鼠CYP17基因構建3條慢病毒shRNA，分別感染體外分離純化培養(yǎng)的大鼠卵巢膜間質(zhì)細胞。卵巢膜間質(zhì)細胞的分離純化采用密度梯度離心法。慢病毒感染卵巢膜間細胞1周后，采用qRT-PCR和Western-blot技術檢測CYP17基因的mRNA和蛋白沉默水平。并采用ELISA技術檢測培養(yǎng)液中雄烯二

16、酮的分泌水平，體外篩選出沉默效率最高的慢病毒shRNA用于整體動物實驗。體內(nèi)實驗采用2個月大SP級雌性SD大鼠共18只，體重為200g，置于SP級動物實驗室飼養(yǎng)。實驗分三組：CYP17干擾組、NS對照組、空白對照組，平均每組6只大鼠。將慢病毒卵巢被膜下注射至大鼠雙側卵巢，觀察GFP熒光并采用qRT-PCR檢測GFP在卵巢組織中的感染效率。提取大鼠卵巢組織總RNA用于CYP17mRNA豐度的檢測，收集血清用于卵巢甾體類激素的測定。

17、　　 結果：所構建的3條慢病毒CYP17 shRNA對CYP17基因均有不同程度地沉默作用。由于慢病毒CYP17shRNA2＃作用最穩(wěn)定，最終選取該條慢病毒shRNA用于整體動物實驗。通過大鼠卵巢被膜下注射慢病毒CYP17 shRNA2＃2周后，將卵巢組織制作冰凍切片，熒光鏡下觀察可見明顯的GFP熒光。GFP qRT-PCR顯示慢病毒注射組的GFP mRNA水平顯著增高，其相對表達水平是空白對照組的7.42倍。通過上述實驗證卵巢被膜下

18、注射的慢病毒已成功感染至卵巢組織。同時，CYP17 qRT-PCR顯示RNA干擾組的CYP17 mRNA豐度顯著降低，平均抑制率達61％。激素測定結果顯示，RNA干擾組的雄烯二酮、17羥孕酮、睪酮均有一定程度地降低，另外孕酮水平也有下降且差異有顯著性。
　　 結論：本研究首次證明采用RNA干擾技術沉默CYP17基因能夠一定程度地抑制卵巢雄激素的合成，這不僅為治療PCOS等高雄激素疾病提供了新的思路，并且為RNA干擾技術在內(nèi)分泌代