AMH對豬卵泡膜細胞類固醇激素合成酶的影響極其機制研究.pdf

1、抗繆勒氏管激素（anti-müllerian hormone，AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）超家族成員之一，由生長卵泡中的顆粒細胞分泌，能夠抑制原始卵泡的募集和降低生長卵泡對促卵泡素的敏感性，但其作用機制尚不清楚。豬是醫(yī)學試驗上理想的動物模型，為了深入探討AMH在對豬卵泡膜細胞在類固醇合成上的作用，開展了如下實驗：
　　試驗一：AMH在豬上的表達模式
　　本試驗主

2、要采用RT-qPCR技術，分析了AMH及AMHR在豬不同組織器官上以及在不同卵泡直徑上的表達規(guī)律；利用ELISA技術，分析了在不同直徑卵泡液中AMH的表達規(guī)律。試驗結(jié)果表明：AMH及AMHR2在豬睪丸和卵巢中高表達，而在其它組織中不表達或表達量極低。顆粒細胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大，AMH的表達量逐漸降低；在大卵泡（＞5mm）顆粒細胞中，AMHR2表達量最高（P<0.05），而小卵泡及中卵泡（直徑1

3、-5mm）的顆粒細胞中AMHR2的表達量最低，且無明顯差異（P＞0.05）。這說明，AMH及AMHR2的表達量與卵泡的生長發(fā)育階段有關。
　　試驗二：豬卵巢卵泡膜細胞的分離純化和培養(yǎng)
　　采用三種方法進行了豬卵泡膜細胞的優(yōu)化，方法A：注射針頭刮去顆粒細胞層，方法B：手術剪碎膜細胞層。A和B法均用IV型膠原酶消化后percoll密度梯度離心獲取44％和35%中間層為膜細胞，C法直接將膜細胞層用IV型膠原酶消化后采用兩次perc

4、oll梯度離心獲取卵泡膜細胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三種蛋白的抗體進行細胞免疫熒光染色鑒定和流式細胞術鑒定細胞純度。結(jié)果表明：方法A獲得的膜細胞存活率及純度均顯著高于方法B和C（92.00% vs.80.33%,85.00%；95.77%vs.87.87%,90.87%）（P<0.05）；方法B獲得的細胞數(shù)顯著高于方法A和C（1.06×107 vs.0.74×107,0.86×107）（P<0.05），但耗時顯著低于方法A和C（2

5、36.67min vs.260.00min，268.33min）（P<0.05）。結(jié)論：方法A可獲得較高膜細胞純度和細胞活力，本實驗為進一步研究膜細胞的功能提供了基礎。
　　試驗三：AMH對卵泡膜細胞上類固醇激素合成酶的影響及機制研究
　　FSH和AMH單獨或是共同添加于卵泡膜細胞中48 h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：在豬卵泡膜細胞中，F(xiàn)SH和AMH無論是單獨作用還是聯(lián)合作用，對LHCGR、STAR、CYP11

6、A1、CYP17A1以及3β-HSD的表達均無顯著影響（P＞0.05），但FSH或AMH單獨作用能夠顯著提高STAR mRNA的表達（P＜0.05），F(xiàn)SH和AMH共同作用對STAR mRNA的表達水平無顯著影響（P＞0.05）。這表明，F(xiàn)SH和AMH在促進類固醇合成起始過程中可能存在協(xié)同作用。
　　LH和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48 h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：在豬卵泡膜細胞中，LH單獨作用能夠誘導LH

7、CGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平上調(diào)（P＜0.05）；AMH單獨作用對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）；LH和AMH聯(lián)合作用時，LHCGR、CYP17A1、3β-HSD mRNA表達水平與對照組及AMH單獨作用組均無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于LH單獨作用組的水平（P＜0.05），而對STAR、CYP11A1

8、mRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）。Forskolin和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)，在豬卵泡膜細胞中，F(xiàn)orskolin能夠顯著上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA的水平（P＜0.05）；Forskolin和AMH共同作用也可上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平，且與Forskolin單獨作用無顯

9、著差異。這表明，在豬卵泡膜細胞上，AMH并不是以cAMP作為通路調(diào)控的。
　　通過普通PCR發(fā)現(xiàn)，豬卵泡膜細胞上存在AMHR2。在AMHR2被siRNA干擾的膜細胞中添加LH和AMH，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：LH能夠上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平（P＜0.05）；但AMH對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平無顯著影響（P＞0

10、.05）；LH和AMH共同作用時，LHCGR、CYP11A1和CYP17A1 mRNA表達水平均與對照組無顯著差異（P＞0.05），而3β-HSD mNRA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。這表明，AMH在卵泡膜細胞上是通過3β-HSD進而調(diào)控LH誘導的類固醇合成。
　　綜上所述，本研究表明，AMH在豬上的表達模式與其它物種的相似，AMH及AMHR2的表達量與卵泡的生長發(fā)育階段有關。首次發(fā)現(xiàn)，豬的卵泡膜細胞上表達AMHR2，并且A