大鼠頸椎骨折錯(cuò)位脊髓損傷模型的行為學(xué)和組織學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 在臨床上常見骨折脫位后脊髓剪切導(dǎo)致的急性脊髓損傷，其中頸脊髓損傷占17.75％～50％。目前脊髓損傷的動(dòng)物研究多采用嚙齒類動(dòng)物，主要模型有切割、挫傷、壓迫等。2005年Fiford首次研究了胸椎橫向骨折錯(cuò)位對脊髓損傷的原發(fā)性損傷的影響。加拿大學(xué)者choo于2007年首次建立了脊柱骨折錯(cuò)位脫位脊髓損傷模型，發(fā)現(xiàn)C4和C5骨折錯(cuò)位2.5mm下的脊髓原發(fā)性損傷與挫傷導(dǎo)致的脊髓損傷不同。Shahrokni研究了該種模型在C

2、5/6水平骨折錯(cuò)位1.50mm后大鼠頸椎固定的生物力學(xué)，但是并沒有脊髓損傷的組織學(xué)和行為學(xué)的研究。
　　 我們前期研究了C4-C5骨折錯(cuò)位1.3，1.6和1.9mm的大鼠原發(fā)性脊髓損傷，所以本課題進(jìn)一步研究其繼發(fā)性損傷，包括傷后8周內(nèi)的組織學(xué)改變和行為學(xué)特點(diǎn)。從行為學(xué)組織病理學(xué)兩方面對該模型進(jìn)行分級(jí)，為該模型的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 本課題將建立不同頸椎骨折錯(cuò)位位移的大鼠原發(fā)性脊髓損傷模型，并在此

3、基礎(chǔ)上分析不同錯(cuò)位位移下的脊髓損傷大鼠的行為學(xué)改變和組織學(xué)特點(diǎn)。
　　 研究設(shè)計(jì)：
　　 本研究共采用42只雄性SD大鼠（體重300g左右），根據(jù)C4/5錯(cuò)位位移分為對照組，1.65mm組和1.80mm組，分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究，即原發(fā)性損傷研究（損傷后即刻處死）和繼發(fā)性損傷研究（8周觀察）。
　　 1.不同錯(cuò)位位移下的脊髓原發(fā)性損傷研究本部分使用18只雄性SD大鼠，體重300g～335g，隨機(jī)分為頸椎骨折錯(cuò)位1.

4、65mm組，頸椎骨折錯(cuò)位1.80mm組和對照組，每組6只。磨鉆去除C4/5雙側(cè)小關(guān)節(jié)。頭側(cè)椎夾置于C2（下1/2）、C3和C4兩側(cè)溝槽（關(guān)節(jié)突與橫突間）中，尾側(cè)椎夾置于C5、C6和部分C7的兩側(cè)溝槽內(nèi)。頭側(cè)椎夾固定于大鼠腦立體定位儀上，尾側(cè)椎夾連接到Instron單軸電磁伺服試驗(yàn)機(jī)，以200mm/s速度向背側(cè)提升尾側(cè)椎夾1.65mm或者1.80mm，停留0.3s，然后以2mm/s的速度回到原位。試驗(yàn)機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)組損傷過程中的力和位移。

5、r>　　 即刻灌注取材，樣本大體觀察和冰凍矢狀位切片HE染色，計(jì)算脊髓白質(zhì)出血量、灰質(zhì)出血量、以及總出血量。
　　 2.不同錯(cuò)位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究本部分使用24只雄性大鼠，體重288-330g，分對照組(n=6)，1.65mm組(n=9)和1.80mm組(n=9)。進(jìn)行相應(yīng)骨折錯(cuò)位后，固定夾固定頸椎，飼養(yǎng)8周，進(jìn)行行為學(xué)和組織學(xué)觀察。
　　 2.1 行為學(xué)研究前肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分:FLS(Forelimb locomo

6、tor score)評(píng)分，在術(shù)前1天，術(shù)后第3和7天，以及術(shù)后第1至8周進(jìn)行開場環(huán)境下錄像，用FLS評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷后的上肢功能改變。
　　 梳理實(shí)驗(yàn):在術(shù)前1天，術(shù)后1-8周，每周一次誘發(fā)大鼠自主梳理，進(jìn)行錄像，評(píng)價(jià)大鼠上肢運(yùn)動(dòng)范圍。
　　 抓力試驗(yàn):在術(shù)前適應(yīng)一周后，術(shù)前1天測量基線值，術(shù)后第4天，以及術(shù)后第1至8周時(shí)分別測量大鼠的左、右上肢拉力，評(píng)價(jià)前肢肌力變化。
　　 2.2 組織學(xué)研究灌注取材在術(shù)后

7、8周，即試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，過量麻醉處死大鼠，多聚甲醛心臟灌注，取C4/5為中心的長約7mm頸段脊髓，蔗糖溶液梯度脫水，干冰速凍，-80℃保存。
　　 行脊髓橫斷面切片，厚度20μm，間隔400μm，取其中10套切片待用，-80℃保存。隨機(jī)抽取4套，分別做HE染色觀察脊髓大體形態(tài)，LFB髓鞘染色檢測脊髓損傷后脫髓鞘情況，NISSL染色計(jì)數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目，以及GFAP免疫組化染色分析膠質(zhì)反應(yīng)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.

8、不同錯(cuò)位位移下的原發(fā)性脊髓損傷研究1.65mm組的大鼠頸椎骨折錯(cuò)位最大力（可視為頸椎間盤斷裂時(shí)的拉力）為(16.45±3.56)N，1.80mm組為(15.57±5.73)N。1.65mm組和1.80mm組的錯(cuò)位速度分別為(199.4±1.7) mm/s和(201.5±2.0) mm/s。
　　 兩組最大力的差異沒有顯著性(P=0.756)。兩組的實(shí)際位移均極為接近目標(biāo)位移。1.80mm組速度與1.65mm組速度兩組間差異無顯著

9、性(P=0.084)。
　　 脊髓出血量計(jì)算:1.65mm組和1.80mm組兩組的白質(zhì)出血量分別為(0.01±0.02) mm3和(0.09±0.05)mm3，兩組的灰質(zhì)出血量為(0.58±0.15) mm3和(0.88±0.21)mm3，灰質(zhì)和白質(zhì)出血量兩組之間差異均有顯著性(P白質(zhì)=0.013，P灰質(zhì)=0.017)。
　　 2.不同錯(cuò)位位移下的頸髓繼發(fā)性損傷研究()行為學(xué)前肢運(yùn)動(dòng)功能FLS評(píng)分:1.65mm組和1.8

10、0mm組術(shù)后第1天均表現(xiàn)為無或僅有一個(gè)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)，F(xiàn)LS評(píng)分分別為(0.8±0.4)和(0.2±0.4)，組間差異無顯著性(P=0.810)。術(shù)后1周時(shí)，1.65mm組的評(píng)分分別為(3.0±1.9)，有兩個(gè)關(guān)節(jié)（即肩關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)）的輕微運(yùn)動(dòng)，而1.80mm組的評(píng)分(6.5±3.0)，有兩個(gè)關(guān)節(jié)（肩關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)）的中度活動(dòng)有或無腕關(guān)節(jié)的輕微活動(dòng)。大鼠脊髓損傷后，前肢運(yùn)動(dòng)功能在1-2周內(nèi)恢復(fù)最快，在第3周時(shí)達(dá)到一個(gè)恢復(fù)平臺(tái)，評(píng)分分別為(1

11、2.2±1.5)和(10.6±1.5)，而后仍有少許恢復(fù)。1.65mm組和1.80mm組在術(shù)后第8周時(shí)前肢評(píng)分分別為(14.3±0.7)和(12.1±0.9)。除第1天外的各時(shí)間點(diǎn)上兩組評(píng)分的差異均有顯著性。
　　 梳理實(shí)驗(yàn):1.65mm組和1.80mm組術(shù)后1周評(píng)分最低，評(píng)分分別為(1.4±0.7和(1.1±0.8)。在術(shù)后第8周時(shí)，評(píng)分分別為(3.4±0.5)和(3.3±0.7)，大鼠前肢最大梳理范圍達(dá)眼框附近。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)

12、，兩組間評(píng)分差異均無顯著性。實(shí)驗(yàn)對照組為滿分5分。
　　 前肢拉力:術(shù)前對照組、1.65mm組和1.80mm組的拉力分別為(1.64±0.08)N、(1.59±0.11)N和(1.63±0.08)N。1.65mm組和1.80mm組術(shù)后1周內(nèi)表現(xiàn)爪子痙攣或者無力狀態(tài)，在第1周時(shí)有輕微抓力，分別為（0.49±0.18）N和（0.83±0.13）N，兩組間的差異有顯著性(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)對照組術(shù)后第1周的拉力為(1.44±0.20

13、)N。1.65mm組和1.80mm組從第1周后隨時(shí)間逐漸恢復(fù)，在第8周時(shí)分別為(1.55±0.24)N和(1.39±0.16)N，均小于實(shí)驗(yàn)對照組(1.87±0.13)N。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，三組的左、右側(cè)拉力的差異無顯著性，說明脊髓損傷的對稱性較好。
　　 組織學(xué)結(jié)果
　　 脊髓損傷后，逐漸形成空洞囊腔，脊髓萎縮，HE染色照片可以觀察到脊髓明顯萎縮變小。脊髓損傷8周時(shí)，1.65mm組脊髓損傷中心處脊髓殘留面積為(3.24±

14、0.82) mm2，1.80mm組為(2.15±0.51)mm2。1.65mm組以損傷處為中心的長度為4mm的脊髓體積為(18.07±2.31) mm3，1.80mm組為(16.01±2.34)mm3，對照組為(25.38±1.05) mm3。三組間脊髓體積的差異均有顯著性。骨折錯(cuò)位越大，損傷程度越重，脊髓殘留體積越小。
　　 脊髓損傷第8周時(shí)，GFAP免疫組化染色后的組織切片上可見灰質(zhì)和白質(zhì)中均膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，特別是在空洞囊

15、腔的邊緣可見大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，呈灶性聚集分布。白質(zhì)和灰質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)胞體變大，突觸減少。1.80mm組可見膠質(zhì)反應(yīng)明顯重于1.65mm組。對照組的膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)小，白質(zhì)中神經(jīng)小膠質(zhì)數(shù)目少，胞體小，突觸細(xì)長，未見明顯的膠質(zhì)活性增生及其他異常等。
　　 脊髓脫髓鞘，在Luxol fast blue染色切片上，計(jì)算以脊髓損傷中心為中點(diǎn)，頭、尾端各2mm，4mm長的脊髓共計(jì)11片切片上的髓鞘LFB染色的總IOD值。對照組總IOD值為(2.

16、87±0.34)×105，1.65mm組為(1.14±0.33)×105，而1.80mm組為(0.54±0.30)×105。1.65mm組和1.80mm組均與對照組的差異均有顯著性(P=0.000)，而1.65mm組的總IOD值大于1.80mm組(P=0.027)。結(jié)果表明:骨折錯(cuò)位位移越大，脊髓白質(zhì)髓鞘脫失越嚴(yán)重。距離脊髓損傷中心尾端1.6mm處的脊髓切片為例，可見實(shí)驗(yàn)組在脊髓損傷區(qū)域的尾端的背側(cè)和腹側(cè)的髓鞘均有明顯脫失。而1.80m

17、m組不論在脊髓背側(cè)還是腹側(cè)的髓鞘脫失都比1.65mm組嚴(yán)重。
　　 尼氏染色后，在脊髓損傷中心神經(jīng)元細(xì)胞的丟失最為明顯，該處1.65mm組和1.80mm組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元幾乎被破壞殆盡。距頭尾端2mm的脊髓，1.65mm組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目少于1.80mm組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）.以距離損傷中心1.2mm為例，1.80mm組在脊髓前角上部?？梢娒黠@增生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞聚集，可見明顯神經(jīng)元細(xì)胞固縮變形或胞體淡