乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1.探討體外條件下乳鼠雪旺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和傳代所需的條件，為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因及移植提供種子細(xì)胞。
　　2.觀察不同濃度腦源性生長(zhǎng)因子培養(yǎng)環(huán)境下，雪旺細(xì)胞增殖與分泌情況。探討腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF)影響體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞增殖及分泌的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法:
　　1.將出生5-7天的乳鼠脫頸處死，在低溫?zé)o菌條件下分離其雙側(cè)坐骨神經(jīng)，雙酶消化法制成單細(xì)胞懸液，加入10％FBS高糖培養(yǎng)基中，置于預(yù)先鋪有多聚賴

2、氨酸的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，采用30分鐘差速貼壁法初步去除成纖維細(xì)胞，將所得到的細(xì)胞懸液置于37℃、5％二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為10-5/L阿糖胞苷進(jìn)一步提純雪旺細(xì)胞。24小時(shí)后換成含有foskilin和牛垂體提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察、記錄雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，繪制生長(zhǎng)曲線。將生長(zhǎng)良好的雪旺胞進(jìn)行傳代，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　2.取出生5-7天的乳鼠坐骨神經(jīng)的雪旺細(xì)胞，分別放

3、入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子+10％胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基中，按培養(yǎng)基中BDNF終濃度為0、10、20、50、100ng/ml，將雪旺細(xì)胞設(shè)立為5組培養(yǎng)1周，利用MTT法觀察并比較雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。ELISA檢測(cè)不用濃度BDNF下，雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、睫狀神經(jīng)節(jié)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor receptor，CNTF）的情況。
　　結(jié)果:<

4、br>　　1.從乳鼠坐骨神經(jīng)中分離出雪旺細(xì)胞。倒置顯微鏡下見培養(yǎng)的細(xì)胞24后開始貼壁，貼壁細(xì)胞多小而圓，較亮，折光較強(qiáng)，不隨液體流動(dòng)而移動(dòng)，少量細(xì)胞呈雙極索形或三角形，胞核成圓形或橢圓形，較多懸浮細(xì)胞。7-8天后，經(jīng)過3次換液。細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞多呈雙極索形，少量細(xì)胞呈三角形，相鄰細(xì)胞之間以突起相連，或相互平行成束狀排列。傳代后細(xì)胞呈雙極索行，貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)S-100的免疫熒光染色鑒定，雪旺細(xì)胞多呈雙極性，相互平行排列，純度最高達(dá)80

5、％。
　　2.BDNF終濃度為50ng/ml、100ng/ml組的雪旺細(xì)胞活力明顯高于BDNF終濃度為0ng/ml的雪旺細(xì)胞的增殖活力，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而BDNF終濃度為10、20ng/ml組與終濃度為0ng/ml組相比，雖然雪旺細(xì)胞的活力有差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。另外，雪旺細(xì)胞能夠分泌NGF、CNTF，當(dāng)BDNF終濃度為50ng/ml、100ng/ml與BDNF終濃度為0ng/ml比較，雪旺細(xì)胞的

6、NGF、CNTF的表達(dá)水平明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且當(dāng)BDNF終濃度為50ng/ml時(shí)，雪旺細(xì)胞的NGF、CNTF的表達(dá)水平明顯最高，但與100ng/ml組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P＞0.05)
　　結(jié)論:
　　1.利用雙酶消化神經(jīng)組織成單個(gè)細(xì)胞后、加入阿糖胞苷抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、再加入foskilin促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖是一種較為快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法，可成功從乳鼠坐骨神經(jīng)中獲取雪旺細(xì)胞。經(jīng)免疫熒光染色后，特