大鼠耳蝸雪旺細胞體外培養(yǎng)、純化及增殖的實驗研究.pdf

1、感音神經性聾是臨床工作中最常見的疾病,其發(fā)病機理和治療方法仍在不斷的探索中,目前認為主要病變部位在初級傳入螺旋神經元(SGN)和耳蝸毛細胞。哺乳動物螺旋神經元和耳蝸毛細胞損傷后幾乎不能再生,那么如何修復受損的SGN,如何使SGN增強在復雜的病理狀態(tài)下的修復能力,如何使SGN在損傷后的特殊微環(huán)境里提高其存活率是感音神經性聾的研究方向之一。雪旺細胞是從胚胎時期周圍神經系統(tǒng)的神經嵴前體細胞演化而來的一種膠質細胞。周圍神經受損后其遠端軸突和髓鞘

2、崩解,此時雪旺細胞可以大量增殖并且吞噬遠端軸突和崩解的變性壞死的碎片。雪旺細胞還可以分泌神經生長因子NGF和神經營養(yǎng)因子NTF,因此雪旺細胞具有可以增加神經元的存活率、促進細胞軸突生長和提高神經元再生的能力。
　　大量研究顯示,移植雪旺細胞能夠促進脊髓、周圍神經損傷的修復并具有加快中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘性疾病功能恢復的作用。然而,目前尚無關于耳蝸雪旺細胞和螺旋神經元軸突的相互作用機制的研究報道和關于耳蝸雪旺細胞與外周神經系統(tǒng)的其他雪旺

3、細胞之間的相似性和差異性的報道。而弄清楚以上問題的關鍵在于純化和定性耳蝸雪旺細胞。所以本研究致力于進行大鼠仔鼠耳蝸雪旺細胞的體外培養(yǎng)、純化的試驗,并配制一種能使耳蝸雪旺細胞快速增殖的培養(yǎng)液配方。
　　實驗一:大鼠耳蝸雪旺細胞體外培養(yǎng)和純化選用1-3d SD大鼠,無菌條件下暴露雙側聽泡,在高倍鏡下仔細剝離蝸殼,開放耳蝸,完整取出耳蝸組織,分離并且除去膜蝸管外側壁的血管紋和基底膜組織,然后剪碎。用0.25％的胰蛋白酶消化,用胎牛血清中

4、止消化,離心以后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。3-5天后對細胞應用免疫磁珠陽性分選方法進行純化,培養(yǎng)2天后進行傳代接種,培養(yǎng)過程中對提純后的大鼠耳蝸雪旺細胞進行形態(tài)學觀察、并繪制其生長曲線,采用細胞免疫熒光染色對細胞進行S-100免疫熒光鑒定并且計算細胞純度。結果:分離培養(yǎng)后所得的細胞即為雪旺細胞;利用免疫磁珠陽性分選法對培養(yǎng)所得的細胞進行純化,純化后的大鼠耳蝸雪旺細胞純度為97％±1.2％。結論:免疫磁珠法是一種有效的分離純化新生大

5、鼠仔鼠耳蝸雪旺細胞的方法。所得雪旺細胞活力強、純度高,可以用于耳蝸雪旺細胞與螺旋神經節(jié)軸突的生長和再生等相關研究。
　　實驗二:耳蝸雪旺細胞增殖的試驗取生長良好的第三代經免疫磁珠分離純化的耳蝸雪旺細胞,消化后制成細胞濃度為1×104/ml的單細胞懸液,接種在96孔板上,每塊6×12孔,每孔加入200μl細胞懸液,共接種10個樣本。將硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和堿性成纖維細胞生長因子bFGF配置成不同濃度的的培養(yǎng)液。37℃,5％C

6、O2培養(yǎng),每日固定時間取一塊板,連續(xù)取10天,用激發(fā)波長為490nm的酶聯免疫測試儀測吸光度值,計算當天各組A值均數,以光吸收值為縱軸,時間為橫軸,繪制六組耳蝸雪旺細胞的生長曲線。
　　結果:B、C、D、E、F組優(yōu)于空白對照組A,有統(tǒng)計學意義(P0.05);B、C、D組之間無明顯差別,無統(tǒng)計學意義;E、F組優(yōu)于B、C、D組,有統(tǒng)計學意義;E、F組之間無明顯差別,無統(tǒng)計學意義。這說明用含硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和堿性成纖維細胞生