種植胎兔雪旺細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)將體外培養(yǎng)提純的胎兔雪旺細(xì)胞種植到經(jīng)化學(xué)萃取處理的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)段中制成的橋接復(fù)合體移植到兔缺損的坐骨神經(jīng)上，觀察移植神經(jīng)周圍免疫細(xì)胞的變化以及坐骨神經(jīng)的再生、功能恢復(fù)情況。探討種植雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的作用和機(jī)制，證實(shí)此種橋接復(fù)合體免疫原性非常小，既能為再生神經(jīng)提供良好的支架作用，又能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)軸突和髓鞘的再生，為臨床上應(yīng)用同種異體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損提供理論依據(jù)。 方法：

2、1.雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔，耳緣靜脈注入空氣處死后迅速取胎兔。應(yīng)用手術(shù)顯微鏡在無(wú)菌條件下取胎兔坐骨神經(jīng)，盡量去除神經(jīng)外膜及束膜，Hank’s液沖洗5遍后將神經(jīng)剪碎。使用雙酶消化法(trypsin/collagenase)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，利用雙差速貼壁法及Arab-C(終末濃度10-5mmol/L)抑制和去除成纖維細(xì)胞，提純后使用NGF(40ng/ml)促進(jìn)SC細(xì)胞生長(zhǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并接種進(jìn)行傳代，收集生

3、長(zhǎng)良好的第二代細(xì)胞計(jì)數(shù)并應(yīng)用S-100蛋白免疫組化鑒定。雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察：經(jīng)傳代的雪旺細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)：雪旺細(xì)胞的濃度已達(dá)到1×108/ml，其典型形態(tài)呈梭形，有突起，多為雙極，偶見三個(gè)細(xì)胞突起。胞核明顯，呈卵圓形。細(xì)胞呈端對(duì)端、肩并肩、漩渦狀或柵欄樣排列生長(zhǎng)。視野內(nèi)仍可見少量成纖維細(xì)胞，胞體較雪旺細(xì)胞大，扁平狀外形不規(guī)則，突起短而多，核仁明顯，有2-3個(gè)核仁，顏色較雪旺細(xì)胞淺。2.去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物制

4、備：取成年健康新西蘭白兔，分別于梨狀肌下緣水平以遠(yuǎn)切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，作為異體神經(jīng)的來(lái)源。神經(jīng)萃取前先在手術(shù)顯微鏡下去除其表面的脂肪組織及部分神經(jīng)外膜，并將其分為3cm的小段，然后置于4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經(jīng)段放入3％TritonX-100溶液中靜置12h，然后置于蒸餾水中震蕩，漂洗6h。如此反復(fù)，TritonX-100共作用時(shí)間為96h，4℃下保存，用于神經(jīng)移植。對(duì)萃取的神經(jīng)段行石蠟切片HE染色及掃描電鏡觀察去細(xì)胞的情況。去細(xì)胞神

5、經(jīng)橋接體的觀察：大體觀察：神經(jīng)萃取過(guò)程中可見兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經(jīng)呈淡乳白色，無(wú)光澤，其外徑及長(zhǎng)度較新鮮神經(jīng)稍減小，柔軟，有韌性。HE染色光鏡觀察：神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)消失，紅染的神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙。掃描電鏡觀察：神經(jīng)內(nèi)的軸突、髓鞘已被完全去除，可見由膠原纖維構(gòu)成的立體管狀結(jié)構(gòu)，部分管腔不規(guī)則。膠原纖維仍維持原有的位置、形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，管內(nèi)并可見膜樣結(jié)構(gòu)，為雪旺細(xì)胞基底膜。3.種植雪旺細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)

6、兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)觀察：將培養(yǎng)的第二代雪旺細(xì)胞以1×108/ml的濃度用100ul的微量注射器注入去細(xì)胞神經(jīng)段內(nèi)，形成同種異體神經(jīng)復(fù)合體，然后將此復(fù)合體迅速移植到兔缺損的一側(cè)坐骨神經(jīng)(實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組移植未注入雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)，術(shù)后1周、4周、8周光鏡觀察移植段坐骨神經(jīng)周圍肌肉組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野免疫細(xì)胞的數(shù)量。術(shù)后4周、8周、16周大體觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況，肉眼觀察神經(jīng)愈合情況；光鏡觀察坐

7、骨神經(jīng)再生和髓鞘形成情況；電鏡觀察神經(jīng)再生和髓鞘形成情況以及軸索、線粒體、微管、微絲和雪旺細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)的變化；應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)再生神經(jīng)纖維數(shù)目、有髓神經(jīng)纖維軸突直徑、髓鞘厚度進(jìn)行量化分析；測(cè)量小腿三頭肌濕重；最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：種植胎兔雪旺細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)觀察：術(shù)后兩組動(dòng)物手術(shù)區(qū)局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，術(shù)后1周移植段坐骨神經(jīng)周圍肌肉組織中有淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組；術(shù)后4周

8、，浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞兩組均較1周后明顯減少，實(shí)驗(yàn)組減少的更明顯。術(shù)后8周，浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞更加減少。術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有顯著差異，而術(shù)后4周、8周兩組之間沒有顯著差異。實(shí)驗(yàn)組足部潰瘍的愈合情況、再生神經(jīng)纖維數(shù)目、有髓神經(jīng)纖維軸突直徑、髓鞘厚度均優(yōu)于對(duì)照組。小腿三頭肌濕重于術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)明顯差異，術(shù)后8周、16周實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組。 結(jié)論：采用雙酶消化法和雙差速貼壁法培養(yǎng)和提純雪旺細(xì)胞并輔以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)可獲取